雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

技術(shù)方法

雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

王淑菁，付瑞，李曉波，王吉，衛(wèi)禮，鞏薇，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，國家實驗動物質(zhì)量檢測中心，北京100050)

【摘要】目的建立雞胚致死孤兒病毒(CELO)和雞減蛋綜合癥病毒(EDS)的多重PCR檢測方法并進(jìn)行初步應(yīng)用。方法參照GenBank提供的基因序列，設(shè)計了2對特異性引物分別擴(kuò)增CELO長纖突蛋白和EDS六鄰體蛋白的基因序列，建立檢測CELO和EDS的多重PCR方法，考察該方法的特異性和敏感性，并使用該方法檢測流感疫苗主種子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染。結(jié)果該多重PCR方法成功擴(kuò)增得到了兩條特異性目的條帶，并經(jīng)測序驗證。該方法特異性好，靈敏度顯示核酸最低檢測量可達(dá)10-4μg/mL。使用該方法檢測12批次流感疫苗主種子批病毒，外源性禽腺病毒的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒的多重PCR檢測方法，靈敏度高，特異性好。在流感疫苗主種子批病毒的外源性禽腺病毒的檢測中具有很高的使用價值和應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】雞胚致死孤兒病毒；雞減蛋綜合癥病毒；禽腺病毒；多重PCR

[基金項目]實驗動物質(zhì)量檢測關(guān)鍵技術(shù)研究(2013BAK11B01)；中檢院中青年發(fā)展研究基金課題(2013NC2)。

[作者簡介]王淑菁(1985-)，女，助理研究員，研究方向：實驗動物病毒學(xué)。Email: wsj2008gogo@163.com。

[通訊作者]賀爭鳴(1957-)，男，研究員，研究方向：微生物學(xué)和免疫學(xué)。Email：zhengminghe57@163.com。

【中圖分類號】S852.65 R332【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.012

Detection of chicken embryo lethal orphan virus and egg drop

syndrome virus by multiplex polymerase chain reaction

WANG Shu-jing，F(xiàn)U Rui，LI Xiao-bo，WANG Ji，WEI Li，GONG Wei，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming

(National Institute for Food and Drug Control，Institute for Laboratory Animal Resources,

National Center for Monitoring of Laboratory Animal Health，Beijing 100050，China)

Abstract【】ObjectiveTo establish multiplex PCR assay for detection of chicken embryo lethal orphan virus(CELO)and egg drop syndrome virus (EDS). Methods According to GenBank gene sequence, two pairs of specific primers designed were amplified CELO long fiber protein and EDS hexon protein gene sequence. The specificity and sensitivity of multiplex PCR were tested. We also use the multiplex PCR to detect exogenous CELO and EDS in influenza virus. ResultsTwo target bands have been successfully amplified and verified by sequencing. The specificity of the method is better, and the sensitivity is 10-4μg/mL. The results of detecting exogenous CELO and EDS in 12 influenza virus were negative. ConclusionThe multiplex PCR assay for detection of CELO and EDS was established successfully, which have good specificity and high sensitivity, and have high value and application prospect for detecting exogenous CELO and EDS in influenza virus.

【Key words】Chicken embryo lethal orphan virus(CELO)；Egg drop syndrome virus (EDS)；Avian adenovirus；Multiplex PCR

雞胚致死孤兒病毒(CELO)屬于禽腺病毒I型，為無包膜雙股DNA病毒。主要引起雞的包涵體肝炎、再生障礙性貧血、呼吸道感染、出血性腸炎和產(chǎn)蛋量減少，常與禽類呼吸道病原微生物混合感染，導(dǎo)致死亡率增加。減蛋綜合癥病毒(EDSV)屬于禽腺病毒III型，為無包膜雙股DNA病毒，感染后主要在輸卵管內(nèi)大量繁殖，形成嗜堿性包涵體，引起產(chǎn)蛋量下降、蛋殼異常和蛋體畸形[1]。

在流感疫苗檢定中，規(guī)定主種子批病毒需進(jìn)行外源禽腺病毒I型和III型的檢測。傳統(tǒng)檢測方法為使用血凝方法、瓊脂擴(kuò)散方法等血清學(xué)方法對雞胚致死孤兒病毒(CELO)和減蛋綜合癥病毒(EDSV)進(jìn)行檢測，存在特異性、敏感性及儀器試劑方面的不足，需建立快速、特異性強(qiáng)的PCR檢測方法[2-4]。

多重PCR是一種可在同一體系中同時檢測多種病原體的分子生物學(xué)方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，能夠?qū)膊∽龅娇焖?、?zhǔn)確的診斷, 適合大量樣品( 特別是混合感染樣品) 中病原體的快速檢測[5-6]。本研究擬建立一種能夠同時檢測雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒的多重PCR方法，以期對流感疫苗主種子批病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測。

1材料和方法

1.1病毒

雞胚致死孤兒病毒(CELO VR-432株)、小鼠腺病毒(MAdV)均購買于美國模式菌種收集中心，雞減蛋綜合癥病毒(EDS AV127株)購于中國獸藥監(jiān)察所。猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均為本科室保存。

1.2引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank提供的基因序列，選擇CELO和EDS保守特異的區(qū)域設(shè)計引物。針對CELO獨有蛋白即長纖突蛋白基因序列設(shè)計一對引物(CELO-172F：5’TGCTGACTACCTCGCTCTAC3’；CELO-172R：5’ATACTGATGTTGCTTGGCTC3’)，擴(kuò)增條帶為172 bp。針對EDS六鄰體蛋白基因序列設(shè)計一對引物(EDS-516F：ACCCGCTTCGTTACACCAT；EDS-516R：CCCTTCGGAGAAATCCCTAC)，擴(kuò)增條帶為516 bp。

1.3病毒DNA的提取

使用Qiagen基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，型號51304)提取病毒DNA，詳細(xì)操作見產(chǎn)品說明書。

1.4單個PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ddH2O 17.35 μL，引物各1 μL，DNA 1 μL，HS Taq酶0.15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳測定。PCR產(chǎn)物送Takara公司進(jìn)行序列測定。

1.5多重PCR反應(yīng)及優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ddH2O 16.35 μL，引物各0.75 μL，CELO DNA 1 μL，EDS DNA 1 μL，HS Taq酶0.15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，退火溫度 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

對多重PCR的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，選擇50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.6特異性試驗

提取小鼠腺病毒、雞胚致死孤兒病毒、雞減蛋綜合癥病毒、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20的DNA，考察該多重PCR方法的特異性。

1.7靈敏度試驗

取CELO DNA與 EDS DNA各10 μL混勻，倍比稀釋混合模板濃度從1～10-9μg/mL，考察該多重PCR方法的靈敏度。

1.8檢測方法的應(yīng)用

應(yīng)用建立的多重PCR方法對流感疫苗主種子批病毒進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1單個PCR檢測體系的建立

CELO經(jīng)特異性引物擴(kuò)增得到172 bp目的片段(圖1)；EDS經(jīng)特異性引物擴(kuò)增得到516 bp目的片段(圖2)。將擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)測序后，與NCBI網(wǎng)站上的序列一致率均為100%。

圖1　CELO擴(kuò)增目的條帶 Fig.1　The PCR result of CELO

圖2　EDS擴(kuò)增目的條帶 Fig.2　The PCR result of EDS

2.2多重PCR檢測體系的建立及優(yōu)化

多重PCR擴(kuò)增CELO、EDS混合模板，得到172 bp和516 bp兩條目的條帶。將兩條帶分布切膠回收，轉(zhuǎn)入T-easy 載體后測序，證實172 bp目的片段與CELO基因序列一致率為100%，516 bp目的片段與EDS基因序列一致率為100%。選擇50℃～60℃的溫度區(qū)間優(yōu)化退火溫度，結(jié)果顯示在該溫度區(qū)間均可擴(kuò)增出兩條特異的目的條帶，沒有非特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生(圖3)。

M：100 bp Marker 圖3　多重PCR擴(kuò)增CELO和EDS Fig.3　The multiplex PCR of CELO and EDS

2.3多重PCR方法特異性測定

以小鼠腺病毒、雞胚致死孤兒病毒、雞減蛋綜合癥病毒、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20做對照，雞胚致死孤兒病毒僅擴(kuò)增得到其172 bp目的條帶，雞減蛋綜合癥病毒僅擴(kuò)增得到其516 bp目的條帶，小鼠腺病毒、猴腺病毒-1，猴腺病毒-20均未擴(kuò)增出條帶(圖4)。

注：M：100 bp Marker；1：陰性對照；2：雞胚致死孤兒病毒；3：雞減蛋綜合癥病毒；4：小鼠腺病毒；5：猴腺病毒-1；6：猴腺病毒-20；7：雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒混合模板(陽性對照)。 圖4　多重PCR的特異性 Note：M：100 bp Marker；1：Negative control；2：CELO；3：EDS；4：MAdv；5：SAdv -1；6：SAdv -20；7：CELO and EDS mixture(Positive control). Fig.4　The specificity test of multiplex PCR

2.4多重PCR方法靈敏性測定

取CELO DNA與EDS DNA各10 μL混勻后進(jìn)行倍比稀釋，模板濃度從1～10-9μg/mL，多重PCR反應(yīng)結(jié)果顯示其靈敏度至10-4μg/mL(圖5)。

注：M：100 bp Marker；1：1 μg/mL；2：10 -1 μg/mL；3：10 -2 μg/mL；4：10 -3 μg/mL；5：10 -4 μg/mL；6：10 -5 μg/mL；7：10 -6 μg/mL；8：10 -7 μg/mL；9：10 -8 μg/mL；10：10 -9 μg/mL；11：陰性對照。 圖5　多重PCR的靈敏性 Note：M：100 bp Marker；1：1 μg/mL；2：10 -1 μg/mL；3：10 -2 μg/mL；4：10 -3 μg/mL；5： 10 -4 μg/mL；6：10 -5 μg/mL；7：10 -6 μg/mL；8：10 -7 μg/mL；9：10 -8 μg/mL；10：10 -9 μg/mL；11：Negative control. Fig.5　The sensibility test of multiplex PCR

2.5多重PCR檢測流感疫苗主種子批病毒

提取送檢的12批次流感疫苗主種子批病毒的DNA，經(jīng)多重PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性(圖6)。

3討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使用PCR技術(shù)快速檢測病原微生物的應(yīng)用越來越多。周斌等[7]使用隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增快速鑒定雞胚致死孤兒病毒。

Yo Okuda等[8]使用PCR-RFLP方法擴(kuò)增禽腺病毒I型長纖突蛋白基因序列，根據(jù)片段大小鑒定其是否為致病性腺病毒。馬震原等[9]使用Taqman探針方法檢測雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒，特異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)10 copies/μL。李文貴等[10]使用套氏PCR檢測產(chǎn)蛋下降綜合征病毒，靈敏度比常規(guī)PCR靈敏100倍，可檢測出0.01fg的DNA模板。目前國內(nèi)尚未報道雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒的多重PCR方法。

在多重PCR反應(yīng)中，設(shè)計特異性的引物是關(guān)鍵。本研究設(shè)計的引物是針對2種禽腺病毒各自保守的基因序列，它們分別是雞胚致死孤兒病毒的長纖突蛋白和雞減蛋綜合癥病毒的六鄰體蛋白基因組序列，這些序列具有高度保守性，因此能作為PCR擴(kuò)增的目的基因[1]。實驗中擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物經(jīng)測序后比對，與NCBI上序列一致率均為100%。此外，對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在50℃～60℃溫度區(qū)間內(nèi)考查退火溫度，結(jié)果表明，在該溫度范圍內(nèi)，多重PCR均能得到很好的擴(kuò)增，沒有非特異性的擴(kuò)增。對新建立的多重PCR方法進(jìn)行特異性和靈敏度考察，其特異性強(qiáng)，靈敏度高，最低核酸檢測量可至10-4μg/mL。

注：M：100 bp Marker；1-12為送檢流感疫苗主種子批病毒；13：雞胚致死孤兒病毒；14：雞減蛋綜合癥病毒；15：雞胚致死孤兒病毒和雞減蛋綜合癥病毒病毒的陽性對照；16：陰性對照。 圖6　多重PCR檢測流感疫苗主種子批病毒 Note：M：100 bp Marker；1-12：Influenza virus；13：CELO；14：EDS；15：CELO and EDS mixture(Positive control)；16：Negative control. Fig.6　The multiplex PCR result for detecting exogenous CELO and EDS in influenza virus

《中華人民共和國藥典》2010年版三部中規(guī)定流感全病毒及裂解疫苗均需對毒種中外源性禽腺病毒進(jìn)行檢測。本研究建立的多重PCR方法能夠?qū)α鞲幸呙缰鞣N子批毒種中雞胚致死孤兒病毒、雞減蛋綜合癥病毒單獨或混合污染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測及鑒定，結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有很高的使用價值和應(yīng)用前景。

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〔修回日期〕2014-09-09