硝酸銀硅膠柱梯度洗脫法純化桐酸甲酯

硝酸銀硅膠柱梯度洗脫法純化桐酸甲酯*

劉蕓雙，傅偉昌

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

摘要：以桐油和甲醇為原料，在NaOH催化下通過酯交換反應(yīng)制備桐油酸甲酯，再采用硝酸銀硅膠柱梯度洗脫法對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得桐酸甲酯.應(yīng)用GC-MS，IR，UV，HPLC對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測和表征，桐酸甲酯純度達(dá)95%，可用于合成桐酸單甘酯、甘二酯，以備深入研究桐酸及其甘油酯化物的生理活性.

關(guān)鍵詞：桐酸甲酯；桐酸；桐油；制備；純化；表征

文章編號：1007-2985(2015)01-0052-05

中圖分類號：TQ646文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-2985.2015.01.012

收稿日期：*2014-09-05

基金項(xiàng)目：湖南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010FJ4117)；吉首大學(xué)校級課題(13JDY054)

作者簡介：劉蕓雙(1988—)，女，山東煙臺(tái)人，吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室碩士研究生，主要從事油脂化學(xué)研究 通信作者：傅偉昌(1969—)，男，湖南沅陵人，吉首大學(xué)研究員，博士，主要從事油脂化學(xué)研究.

共軛亞麻酸(Conjugated linolenic acid，CLNA)是一組十八碳共軛三烯酸的統(tǒng)稱，因雙鍵位置和構(gòu)型不同而有多種異構(gòu)體.α-桐酸(9c,11t,13t-CLNA，α-eleostearic acid，α-ESA)是天然存在的一種重要的共軛亞麻酸，在桐油和苦瓜籽油中大量存在[1-4].研究結(jié)果表明，CLNA具有抗癌(細(xì)胞毒性)[1-5]、抗致癌(抑制腫瘤形成)、改變脂代謝和增強(qiáng)機(jī)體免疫[6-7]等多種生理功能，動(dòng)物體內(nèi)代謝可轉(zhuǎn)變?yōu)閏is9,trans11-CLA[8-9].

天然油脂與甲醇的酯化反應(yīng)是制備生物柴油的重要工藝過程.油桐是我國4大木本油料植物之一，具有易種植、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn).以桐油和甲醇為原料制備生物柴油(脂肪酸甲酯的混合物)的研究已見報(bào)道.筆者制備、純化、表征桐酸甲酯是計(jì)劃以桐酸甲酯為原料，合成桐酸單甘酯、甘二酯，以備深入研究桐酸及其甘油酯化物的生理活性.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：桐油，張家界市家家耀油脂廠；甲醇、氫氧化鈉、硝酸銀、石油醚、乙醚，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，AR；乙腈、正己烷、異丙醇，上海阿達(dá)瑪斯有限公司，HPLC；硅膠，青島海浪硅膠干燥劑有限公司.

儀器：7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；Agilent 1206型高效液相色譜儀，美國Aglient公司；U-3900型紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；Nicolet iS10型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Scientific公司；AEL-40SM十萬分之一分析天平，日本島津公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司.

1.2 桐酸甲酯的合成

在250 mL的三口燒瓶中加入一定質(zhì)量的桐油(100 g)，安裝冷凝回流裝置，置于恒溫水浴鍋中加熱；桐油達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需溫度(70 ℃)后，加入配制好的NaOH甲醇溶液，甲醇按與桐油物質(zhì)的量之比6∶1的比例加入，NaOH為桐油質(zhì)量的1%，開啟磁力攪拌，反應(yīng)約1 h后，停止反應(yīng)，加適量磷酸中和.趁熱將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置，分出甘油層(下層)，將上層的液體用熱蒸餾水洗滌2～3次，除去下層的水相，常壓下蒸餾，除去甲醇及大部分水等.用無水硫酸鈉干燥，即得到桐油甲酯化產(chǎn)物[10-11].

1.3 桐酸甲酯的分離純化

桐酸甲酯的分離純化采用硝酸銀硅膠柱層析法.

硝酸銀硅膠的制備[12]：稱取100 g層析硅膠(100～200目)加入含有20 g硝酸銀的水溶液160 mL(使其浸沒硅膠)，在沸水浴中加熱30 min(時(shí)加攪拌)，冷卻，抽濾，在120 ℃的條件下活化16 h以上，備用.

裝柱[13]：取活化后的硝酸銀硅膠，加入適量石油醚，攪拌，勻漿后靜置1 h，使硅膠充分溶脹.在層析柱底部加入約1 cm高的石英砂，加入20 mL石油醚，將溶脹后的硅膠緩慢地傾入，柱外用黑紙包裹，用石油醚平衡2 h后使用.

上樣：待層析柱內(nèi)液面高于硅膠面0.5 cm時(shí)，開始上樣.稱取一定質(zhì)量的桐油甲酯化樣品，緩慢滴加入柱內(nèi)，注意不要使硅膠面有浮動(dòng).

洗脫[14]：洗脫體系為含有乙醚的石油醚混合液，依次用v乙醚∶v石油醚=0∶1，2∶98，4∶96，5∶95，6∶94各100 mL，以1～1.5 mL/min洗脫流速進(jìn)行梯度洗脫，每40 mL收集液為一個(gè)樣品，按收集順序編號，直至桐酸甲酯被洗脫完全.分析收集液中桐酸甲酯的含量.

1.4 桐酸甲酯的分析

1.4.1 GC-MS分析對桐油甲酯化后未經(jīng)硝酸銀硅膠柱分離的混合脂肪酸甲酯和各段收集液稀釋到合適的濃度后分別進(jìn)行GC-MS分析[15].

色譜條件：Agilent 190191S-433型石英毛細(xì)管柱(325 ℃，30 min×250 min×0.25 μm)，載氣為高純度的氦氣(99.999%)，柱內(nèi)載氣流速為1 mL/min；升溫程序?yàn)?50 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持20 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1 μL.

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能70 eV，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲3 min，四級桿質(zhì)量分析器.

1.4.2 HPLC分析對桐油甲酯化后未經(jīng)硝酸銀硅膠柱分離的混合脂肪酸甲酯和桐酸甲酯含量最高的洗脫收集液分別進(jìn)行HPLC分析[16].

色譜條件：色譜柱(Kromasil 100-5C18,250×4.6 mm)，紫外檢測器檢測波長270 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL.流動(dòng)相A：乙腈，B：v異丙醇∶v正己烷= 5∶4，0 min時(shí)70% A+30% B，20 min內(nèi)變?yōu)?0%A+50%B，10 min內(nèi)變?yōu)?00%B，流速0.6 mL/min.

1.4.3 UV分析對桐酸甲酯含量最高的洗脫收集液進(jìn)行UV分析.掃描范圍400～200 nm.

1.4.4 IR分析采用美國Nicolet iS10型傅立葉變換紅外光譜儀對桐酸甲酯含量最高的洗脫收集液進(jìn)行IR分析.掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1.

2結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析

桐油甲酯化后未經(jīng)硝酸銀硅膠柱分離的混合脂肪酸甲酯及純化后所得的桐酸甲酯，經(jīng)GC-MS分析的總離子流見圖1，2.

圖1　桐油混合脂肪酸甲酯的GC-MS總離子流

圖2　純化后桐油酸甲酯的GC-MS總離子流

根據(jù)圖1的保留時(shí)間和峰面積可以得出各個(gè)峰所代表的脂肪酸及其占總脂肪酸的比例.桐油中各類脂肪酸及其相對含量見表1.

表1　桐油主要脂肪酸組成

注：序號1，6因相對含量過低，在圖形中無法體現(xiàn)，故圖1中未標(biāo)出.

由圖1及表1可知，在該條件下桐油混合脂肪酸甲酯中的各脂肪酸甲酯組分都得到了很好的分離[17].據(jù)GC-MS分析結(jié)果及文獻(xiàn)[18-21]，出現(xiàn)在保留時(shí)間為22.26，24.86，25.47 min的峰可判斷為桐酸甲酯峰，峰面積很大，反映出桐油中的主要脂肪酸為桐酸，約占70.71%，是桐油的特征脂肪酸.除此之外，桐油中還檢測出其他7種脂肪酸，分別為9.27%的飽和脂肪酸(2.87%的棕櫚酸、3.98%的硬脂酸、2.42%的花生酸)，12.35%的油酸，9.39%的亞油酸及少量的亞麻酸(0.66%)，不飽和脂肪酸占93.13%，各脂肪酸含量與文獻(xiàn)報(bào)道的桐油中脂肪酸組成含量基本一致(其脂肪酸組成因產(chǎn)地、品種、加工方法、貯存等條件不同而稍有差異).由以上分析可知，桐油中不飽和脂肪酸組分存在形式較多且集中，共軛十八碳三烯酸的存在則決定其可能具有不同的生物活性功能[22].

對經(jīng)硝酸銀硅膠柱處理的各段收集液進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果見表2.

表2　收集液中脂肪酸甲酯的相對含量　%

由圖2及表2可知，桐油甲酯化混合物中的桐酸甲酯經(jīng)硝酸銀硅膠柱得到了很好的分離、純化，純度達(dá)95%以上.

2.2 高效液相色譜法分析

圖3為桐油甲酯化未經(jīng)硝酸銀硅膠柱分離的混合脂肪酸甲酯的HPLC圖譜.圖4為桐酸甲酯含量最高的洗脫收集液的HPLC圖譜.

圖3　桐油混合脂肪酸甲酯的HPLC圖譜

圖4　純化后桐酸甲酯的HPLC圖譜

因共軛亞麻酸不穩(wěn)定，沒有商品化的α-桐酸標(biāo)準(zhǔn)品提供，故在HPLC分析中，確定α-桐酸相對含量的方法不是很完善.筆者根據(jù)桐油混和脂肪酸甲酯的GC-MS結(jié)果，對比其HPLC圖譜(圖3)，可知圖4中保留時(shí)間為6.18 min的峰為桐酸甲酯峰，通過相對峰面積歸一化定量[16]，α-桐酸的相對含量與表2基本吻合，達(dá)到95%.對比圖3和圖4可知，硝酸銀硅膠柱對桐酸甲酯的分離效果很好.

2.3 UV分析

共軛脂肪酸在紫外區(qū)有最大吸收峰，共軛雙鍵越多，最大吸收峰越向長波方向移動(dòng).共軛三烯酸在260，270，280 mn左右有3個(gè)吸收峰，雙鍵的順反結(jié)構(gòu)對吸收峰的位置略有影響[23].圖5為桐酸甲酯含量最高的洗脫收集液在200～400 nm波段內(nèi)的全波長掃描圖譜.由圖5可看出，桐酸甲酯的最大吸收峰出現(xiàn)在269 nm處，呈現(xiàn)共軛三烯酸的特征吸收峰，與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的共軛亞麻酸的特征吸收波長范圍基本相符，出現(xiàn)的差異可能是因溶劑不同而導(dǎo)致.

2.4 IR分析

圖5　桐酸甲酯紫外光譜圖

圖6　桐酸甲酯紅外光譜圖

3結(jié)論

桐油脂肪酸成分較為簡單，主要脂肪酸為桐酸，含量達(dá)70.71%.以桐油和甲醇為原料，NaOH為催化劑的桐油甲酯化反應(yīng)，綜合GC-MS，HPLC，UV，IR分析結(jié)果，反應(yīng)產(chǎn)物主要為桐酸甲酯.利用硝酸銀硅膠柱，以加入不同比例乙醚的石油醚為洗脫液對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，GC-MS跟蹤監(jiān)測分離產(chǎn)物，結(jié)果表明硝酸銀硅膠柱分離效果良好，桐酸甲酯的純度可達(dá)95%以上.

參考文獻(xiàn)：

[1]SUZUKI R,NOGUCHI R,OTA T,et al.Cytotoxic Effect of Conjugated Trienoic Fatty Acids on Mouse Tumor and Human Monocytic Leukemia Cells.Lipids,2001,25(5):477-482.

[2]TSUZUKI T,TOKUYAMA Y,IGRASHI M,et al.Tumor Growth Suppression by α-Eleostearic Acid,a Linolenic Acid Isomer with a Conjugated Triene System,via Lipid Peroxidation.Carcinogenesis,2004,25(8):1 417-1 425.

[3]KOHNO H,SUZUKI R,NOGUCHI R,et al.Dietary Conjugated Linolenic Acid Inhibits Azoxyethane-Induced Colonic Aberrant Crypt Foci in Rats .Cancer Science,2002,93(2):133-142.

[4]孫翔宇,高貴田,趙金梅,等.α-桐酸的研究進(jìn)展.中國油脂,2012,37(10):52-56.

[5]IHARASHI M,MIYAZAWA T.Preparation and Fractionation of Conjugated Trienes from Alpha-Linolenic Acid and Their Growth Inhibitory Effects on Human Tumor Cells and Fibroblasts.Lipids,2005,40(1):109-113.

[6]ARAO K,WANG Y M,INOUE N,et al.Dietary Effect of Pomegranate Seed Oil Rich in 9cis,11trans,13cis Conugated Linolenic Acid on Lipid Metabolism in Obese,Hyperlipidemic OLETF Rats.Lipids Health Dis,2004(3):24.

[7]YAMASAKI M,KITAGAWA T,KOANAGI N,et al.Dietary Effect of Poegranate Seed Oil on Immune Function and Lipid Metabolism in Mice.Nutrition,2006,22(1):54-59.

[8]袁高峰,李鐸.從苦瓜中提取制備α-桐酸及其鹽和酯的方法：中國，CN101429113A.2009-05-13.

[9]袁高峰,孫海燕,李鐸.植物種子共軛亞麻酸含量分析.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2011,37(3):326-331.

[10] 陳陶靜,趙景嬋,藍(lán)春波,等.陜南桐油中脂肪酸組成的氣質(zhì)聯(lián)用分析.中國林副特產(chǎn),2012(6):13-15.

[11] 杜勛軍.桐油制備生物柴油及改性聚氨酯研究.長沙：中南林業(yè)科技大學(xué),2012.

[12] 李京民,王靜萍.植物油脂中脂肪酸的分離與鑒定方法.中國油脂,1994，19(2):32-37.

[13] 張良,劉美玲,董強(qiáng),等.硝酸銀硅膠柱分離純化蛇鯔魚油中的EPA和DHA.中國糧油學(xué)報(bào),2011,26(12):63-67.

[14] 張汆,闞建全,陳宗道.硝酸銀-硅膠純化α-亞麻酸的研究.離子交換與吸附,2005,21(1)：47-54.

[15] 傅偉昌,盤賽昆,顧小紅,等.癩葡萄籽油脂肪酸組成的GC-MS分析.中國油脂,2007,32(12):79-82.

[16] 傅偉昌.癩葡萄籽油甘油三酯結(jié)構(gòu)及其體外抗腫瘤功效研究.無錫：江南大學(xué),2009.

[17] 陳云鋒,任軒,張永琴.氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定生物柴油中脂肪酸甲酯及亞麻酸甲酯含量.中國油脂,2013，38(11):75-77.

[18] 付梅軒,陳燕.我國主要產(chǎn)區(qū)的桐油脂肪酸組成.中國油脂,1985(1):2-8.

[19] 劉家欣,朱苗力,黃誠,等.湘西桐油中脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜法分析.化工世界,1998(9):493-494.

[20] 陽艷,張 敏.湘西桐油中脂肪酸分析方法的研究.中國林副特產(chǎn),2007(4):5-7.

[21] 姜東亮,馬彩霞,肖婭萍.絞股藍(lán)種子中α-桐酸的定性和定量分析.光譜實(shí)驗(yàn)室,2012，29(3):1 848-1 853.

[22] 紀(jì)白慧.石榴籽和石榴皮生物活性成分的研究.無錫：江南大學(xué),2013.

[23] 傅偉昌,陳尚衛(wèi),顧小紅,等.癩葡萄籽油的脂肪酸分布分析及共軛亞麻酸的鑒定.中國油脂,2009,34(5):75-79.

[24] 肖嫻.水性丙烯酸改性醇酸樹脂涂料的合成和性能研究.北京：北京化工大學(xué),2007.

[25] 明朗,陳哲,張軍,等.近紅外光譜法檢測甘油酸酯及游離脂肪酸.光譜實(shí)驗(yàn)室,2013，30(3):1 418-1 421.

Purification of Methyl Eleostearate by the AgNO3-Silca Gel

Column Gradient Elution Method

LIU Yunshuang,FU Weichang

(Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering,

Jishou University,Zhangjiajie 427000,Hunan China)

Abstract:Fatty acid methyl esters of tung oil were synthesized by transesterification of tung oil and methanol with NaOH as catalyst.The AgNO3-silca gel column gradient elution method was used for the separation of reaction product to obtain methyl eleostearate.The methyl eleostearate was characterized by GC-MS,IR,UV and HPLC.The purity of the final methyl eleostearate was found to be 95%.For further study of biological activities of eleostearic acid and its glyceryl ester compound,the methyl eleostearate can be used to synthesize monoglyceride and diglyceride of eleostearic acid.

Key words:methyl eleostearate;eleostearic acid;tung oil;synthesis;purification;characterization

(責(zé)任編輯向陽潔)