livin蛋白在肺癌胸腔積液中的表達及其評估晚期肺癌預(yù)后的價值

謝軍平 彭賴水 徐慧 牛琳霞 楊梅 袁世洋 陶曉南

1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（南昌330006）；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸科（武漢430022）

肺癌是臨床上最常見的腫瘤之一，研究顯示，肺癌初診時大約有15%病例有胸腔積液，約有40%的患者在疾病進展過程中出現(xiàn)胸腔積液［1］，胸水的出現(xiàn)意味著病情進展到晚期和預(yù)后較差。且對于良、惡胸腔積液的鑒別，長期以來都是困擾臨床醫(yī)生的難題之一，因此尋找胸腔積液中高敏感性、高特異性的可溶性腫瘤標(biāo)志物具有重要意義［2-3］。

Livin基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抗凋亡基因，它在正常成人的大多數(shù)組織中均不表達，但卻高表達于許多腫瘤組織中，有研究報道livin蛋白過表達在許多肺癌細胞株和原發(fā)性肺癌中，livin是肺癌組織較為特異的基因，在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［4-5］。目前胸水livin蛋白對肺癌診斷及預(yù)后的價值未見報道，因此本研究通過檢測胸腔積液中l(wèi)ivin蛋白表達狀況，探討其在肺癌致惡性胸腔積液中的診斷價值（包括診斷的特異性和敏感性）及其對晚期肺癌預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選標(biāo)準：未經(jīng)任何治療的中到大量胸腔積液的肺癌患者及非腫瘤患者。

排除標(biāo)準：只有原發(fā)于肺的惡性腫瘤方可入選，其他部位來源的惡性胸水不納入；伴其他癌癥、全身性結(jié)締組織、風(fēng)濕性疾病者、嚴重肝腎功能不全、嚴重低蛋白血癥以及伴嚴重心衰引起胸水患者不納入；伴肺癌的漏出液患者不納入。

選取2013-2016年南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科及腫瘤科收治的肺癌合并胸腔積液患者72例作為肺癌組，其中腺癌42例（無靶基因突變，未進行靶向治療）、鱗癌30例。所有患者臨床資料完整且收集標(biāo)本前均未經(jīng)治療，全部病例均經(jīng)電子支氣管鏡（或）病理活檢或細胞學(xué)確診等確定其病理類型，另選取同期在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院的性別、年齡及吸煙狀態(tài)與肺癌組相匹配的良性肺部病變伴胸腔積液患者65例作為對照組，其中結(jié)核性胸膜炎22例、肺炎18例、肺膿腫14例、胸部外傷2例、肝硬化5例、心力衰竭4例。肺癌組患者都在本院首次確診，確診后適合化療的均行含鉑藥物（順鉑或卡鉑）為基礎(chǔ)行聯(lián)合化療，并隨訪統(tǒng)計生存率。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集與處理 患者行胸穿抽取胸水60 mL，離心后，收集上清并保存于-80℃冰箱內(nèi)，用于測定livin水平。收集樣本的同時記錄患者住院號、電話等基本信息，以便了解患者的診治情況及隨訪。

1.2.2 胸腔積液livin蛋白檢測 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測胸腔積液livin蛋白水平，ELISA試劑盒均購自美國R&D System公司，所有操作均嚴格按照相應(yīng)說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)。livin蛋白水平以±s表示，兩個組之間的比較采用t檢驗，使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估livin蛋白水平對肺癌診斷的敏感性和特異性；采用Kaplan?Meier法進行生存分析，生存率曲線組間比較采用Log?rank檢驗，Cox回歸模型進行預(yù)后因素分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者基本特征及胸腔積液livin蛋白水平與臨床病理因素的關(guān)系 如表1所示，肺癌患者胸腔積液livin蛋白水平與患者年齡、性別、吸煙狀況、病理類型均無關(guān)（P＞0.05），而在肺癌不同分化程度、腫瘤大小及有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低分化、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤＞7 cm的患者胸腔積液livin蛋白水平較高。

表1 肺癌患者胸腔積液livin蛋白的水平與臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 The relationship between the livin protein level of the pleural effusion and the clinicopathological factors in the patients with lung cancer ±s

表1 肺癌患者胸腔積液livin蛋白的水平與臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 The relationship between the livin protein level of the pleural effusion and the clinicopathological factors in the patients with lung cancer ±s

臨床病理因素年齡（歲）≤60＞60性別例數(shù)livin（ng/mL）P值32 40 2.52±0.14 2.63±0.07 0.90男 女49 23 2.27±0.08 2.78±0.15 0.21吸煙狀況是 否52 20 2.61±0.08 2.72±0.18 0.52病理類型鱗癌腺癌分化程度低分化中/高分化腫瘤大小（cm）≤7＞7頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 42 2.68±0.10 2.57±0.11 0.43 43 29 2.95±0.09 2.13±0.09＜0.000 1 41 31 2.31±0.08 2.99±0.12＜0.000 1有 無40 32 2.31±0.54 2.09±0.67 0.02

2.2 良、惡性胸腔積液livin蛋白水平比較 肺癌組惡性胸腔積液livin蛋白水平顯著高于對照組良性胸腔積液［（2.58±0.07）ng/mLvs.（0.89±0.04）ng/mL，P＜ 0.000 1］。

2.3 livin蛋白水平對肺癌惡性胸腔積液的診斷價值 ROC曲線分析顯示，胸水livin蛋白水平對診斷肺癌的最佳切分值為2.43 ng/mL，ROC曲線下面積為0.725（95%可信區(qū)間0.657～0.793，P＜0.01），根據(jù)切分值，可將肺癌患者分為livin蛋白高水平組（＞2.43 ng/mL）和livin蛋白低水平組（≤ 2.43 ng/mL），其對診斷肺癌惡性胸腔積液的敏感性為67.00%，特異性為73.10%（圖1）。

2.4 肺癌患者生存期分析 對入組的72例肺癌患者進行隨訪，其中9例患者隨訪中給予剔除（因患者死于意外或其他疾病），肺癌患者1年生存率為34.6%。livin蛋白高水平組（＞2.43 ng/mL）中位生存期（P25，P75）為9（4，10）個月，livin蛋白低水平組（≤ 2.43 ng/mL）中位生存期（P25，P75）為 12（6，16）個月。livin蛋白低水平組患者總生存期顯著長于livin蛋白高水平組（P＜0.05），不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、分化程度及有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者總生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2、圖2）。Cox比例風(fēng)險回歸分析顯示：胸腔積液中l(wèi)ivin蛋白可作為判定伴有胸腔積液的肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，HR為3.402（95%CI：1.823～4.760，P＜0.05），提示若肺癌患者胸腔積液livin蛋白水平較高，則患者預(yù)后較差（表2）。

圖1 ROC曲線分析livin蛋白對肺癌伴惡性胸腔積液的診斷價值Fig.1 ROC curve analysis of Livin protein in the diagnosis of lung cancer with malignant pleural effusion

3 討論

胸腔積液是臨床上常見的征象，肺癌、肺結(jié)核、結(jié)締組織病、肺炎等許多疾病可伴有胸腔積液，惡性胸腔積液是指原發(fā)于胸膜腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移到胸膜引起的胸液，約50%的腫瘤轉(zhuǎn)移患者有惡性胸腔積液，其中以肺癌為首位［6］。由于良性胸腔積液和惡性胸腔積液的治療和預(yù)后截然不同，故對兩者進行鑒別具有重要的意義。對于良、惡胸腔積液的鑒別長期以來成為困擾臨床醫(yī)生的難題之一。常用的各種檢查方法都有其局限性，如細胞學(xué)檢查一直是惡性胸腔積液的主要診斷手段，但其敏感性低，僅有40%～60%［7］，難以滿足臨床需要；胸膜針刺活檢陽性率也并不高，因部分惡性胸腔積液患者僅臟層胸膜受累，且壁層胸膜的轉(zhuǎn)移灶常呈斑點狀；其他檢查如支氣管鏡檢查、胸腔鏡檢查等各種方法也有許多缺陷，且陽性率也不能令人滿意。因此，尋找胸腔積液中高敏感性、高特異性的可溶性腫瘤標(biāo)志物成為人們研究的一個熱點。Livin基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抗凋亡基因，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的新成員，是最強的凋亡抑制因子之一，它有2種剪切方式，分別編碼298個氨基酸的 livin α（39 kDa）及編碼 280 個氨基酸的 livin β（37 kDa），兩者的主要區(qū)別是在BIR與RING的連接區(qū)域，livin β缺少54 bp的堿基對，正好編碼18個氨基酸，在livin α中增加的18個氨基酸可形成一個α螺旋結(jié)構(gòu)，因此，兩種異構(gòu)體在功能上會存在一定的差別［8-9］。人livin蛋白的組織分布特征具有明顯的細胞選擇性和腫瘤特異性，它在正常成人的大多數(shù)組織中均不表達，但卻高表達于許多腫瘤組織中，如黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、乳癌、子宮頸癌、前列腺癌［10-11］。有研究報道livin蛋白過表達在許多肺癌細胞株和原發(fā)性肺癌中［4-5］，許多肺癌患者體內(nèi)存在抗livin抗體和抗livin細胞免疫反應(yīng)［12］。以上研究說明livin是肺癌組織較為特異的基因，在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。目前國內(nèi)外大量研究主要針對腫瘤患者組織標(biāo)本中l(wèi)ivin蛋白的表達，關(guān)于livin蛋白在肺癌胸腔積液中的表達狀況未見報道。本研究顯示肺癌致惡性胸腔積液中可檢測到livin蛋白的表達，且肺癌組惡性胸腔積液livin水平明顯高于對照組良性胸腔積液，ROC曲線分析顯示livin水平的切分值為2.43 ng/mL時，其診斷惡性胸腔積液的敏感性（67.00%）和特異性（73.10%）較高，因此，livin是良、惡性胸腔積液鑒別診斷有意義的生物學(xué)標(biāo)志物之一，對良惡性胸腔積液診斷與鑒別診斷具有良好特異性和敏感性。

表2 肺癌伴惡性胸腔積液患者總生存期的單因素分析及多因素分析Tab.2 Single factor analysis and multiple factor analysis of total survival time in patients of lung cancer with malignant pleural effusion

圖2 肺癌患者胸腔積液livin水平與總生存期的關(guān)系Fig.2 Relationship between livin level of pleural effusion and total survival in patients with lung cancer

傳統(tǒng)的影響肺癌預(yù)后的因素包括腫瘤大小、腫瘤的分期、局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等，另外一些癌基因或抑癌基因的異常（如k?ras、p53基因的基因突變）等都是影響預(yù)后的因素［13-15］，然而對晚期肺癌（ⅢB期或Ⅳ期）來說，影響預(yù)后的基因，目前國內(nèi)外報道甚少。有研究認為，livin基因的表達與腫瘤的臨床病理學(xué)參數(shù)（如惡性程度、疾病的進展）密切相關(guān)，阻斷l(xiāng)ivin的表達可促進腫瘤細胞的凋亡及增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［16］。因此livin基因的表達可能成為腫瘤患者一種預(yù)測預(yù)后標(biāo)志物，目前國內(nèi)外關(guān)于livin蛋白在肺癌胸腔積液中的表達情況以及它對晚期肺癌患者臨床預(yù)后的價值未見報道。本研究結(jié)果顯示，在肺癌伴胸腔積液患者中，livin低水平組（≤2.43 ng/mL）總生存期明顯高于livin高水平組（＞2.43 ng/mL）。對肺癌患者進行Cox比例風(fēng)險回歸分析，結(jié)果顯示惡性胸水中l(wèi)ivin蛋白表達水平是晚期肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，并且由此推測肺癌患者胸腔積液中l(wèi)ivin水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

總之，胸腔積液livin蛋白水平可作為肺癌伴胸腔積液診斷及預(yù)后評判的獨立指標(biāo)，未來關(guān)于胸腔積液中l(wèi)ivin蛋白表達對肺癌診斷及預(yù)后價值的研究仍需大規(guī)模的臨床研究進行確認，并且可考慮胸水livin蛋白與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測以提高對肺癌診斷的敏感性和特異性。