重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail 聯(lián)合吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

陳培生，鄧三花，王偉飛，何鋒堅，何 瓊，岳 輝

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510630

胰腺癌是消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，胰腺癌早期診斷困難，手術(shù)切除率低，近90%的患者在確診胰腺癌后1 年內(nèi)死亡，而5 年生存率不足5%，是消化系統(tǒng)腫瘤中預(yù)后最差，有“癌中之王”之稱［1-2］。由于傳統(tǒng)的治療方法有其自身的局限性，因此，尋找胰腺癌的新治療方法成為當(dāng)務(wù)之急。本研究利用能特異誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trai 及胰腺癌化療中的金標(biāo)準(zhǔn)化療藥-吉西他濱，觀察兩者聯(lián)合作用誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及抗體 質(zhì)粒小量提取試劑盒、Lipofectmine-LTX 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen);小牛血清(四季清公司);兔抗Trail 單克隆抗體(CST);辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(中杉金橋公司);吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，純度99%以上)。

1.2 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞(天根公司);重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail(含有Survivin340 啟動子序列及全長Trail cDNA 序列)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 細(xì)胞 SW1990 胰腺癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。用10%滅活小牛血清的新鮮RPMI 1640 培養(yǎng)，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及Western blotting 檢測 用lipofectamine-LTX 轉(zhuǎn)染試劑盒將重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/SurP/Trail 導(dǎo)入SW1990 胰腺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染72 h 后檢測各組細(xì)胞中Trail 表達(dá)的情況，將上清液、純化后的蛋白和蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，用Western blotting Chemiluminescence 試劑盒檢測各組細(xì)胞Trail 的表達(dá)。

1.5 雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 將SW1990胰腺癌細(xì)胞分為4 組，聯(lián)合組:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SurP/Trail 重組質(zhì)粒并加入20 μmol/L 吉西他濱;重組質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒;吉西他濱組:加入20 μmol/L 吉西他濱;空白對照組:未加任何處理。處理48 h 后收集各組細(xì)胞，參照Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒提供方法，處理細(xì)胞后用雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用s 表示，組間多重比較采用Bonferroni 方法分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting 檢測Trail 在各組SW1990 胰腺癌細(xì)胞的表達(dá) 重組質(zhì)粒組及聯(lián)合組均有Trail 蛋白表達(dá)，吉西他濱組和空白對照組則無Trail 蛋白表達(dá)(見圖1)，說明SW1990 胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后能特異性表達(dá)Trail 蛋白。

圖1 Western blotting 檢測Trail 蛋白表達(dá)的情況 1:聯(lián)合組;2:重組質(zhì)粒組;3:吉西他濱組;4:空白對照組Fig 1 Trail protein expression in four group by Western blotting cells 1:the combination group;2:the recombinant plasmid group;3:the gemcitabine group;4:the control group

2.2 雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析各組SW1990 胰腺癌細(xì)胞的凋亡率 經(jīng)處理后，聯(lián)合組、重組質(zhì)粒組、吉西他濱組、空白對照組SW1990 胰腺癌細(xì)胞的凋亡率(%)分別為10.59±0.64、5.05 ±0.50、4.95 ±0.51、2.67 ±0.34。聯(lián)合組的SW1990 胰腺癌細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);重組質(zhì)粒組與吉西他濱組的細(xì)胞調(diào)亡率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);重組質(zhì)粒組和吉西他濱組與空白對照組比較，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討論

近些年來，隨著分子生物學(xué)及分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因治療逐漸成為近幾年研究的熱點(diǎn)，尤其是腫瘤的基因治療已成為腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)，靶向性是基因治療中有待解決的難點(diǎn)，因此，選擇能在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)的殺傷基因成為基因治療的關(guān)鍵。腫瘤殺傷基因的靶向性表達(dá)原理是將具有腫瘤特異性的啟動子序列與腫瘤殺傷基因相偶聯(lián)，使帶有啟動子的腫瘤殺傷基因只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，從而減輕對正常組織的損傷。

Survivin 啟動子可用作腫瘤靶向治療的工具，啟動下游殺傷基因特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，從而避免損傷正常細(xì)胞。研究已證實(shí)Survivin 啟動子在腫瘤細(xì)胞中的活性超過了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的高活性工具啟動子—病毒SV40 啟動子的2 ～3 倍［3］。許多研究已證實(shí)Trail 蛋白具有殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性［4］，其與受體DR4 和DR5 結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Ozawa 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中DR4 和DR5 的mRNA 水平明顯高于正常胰腺組織的表達(dá)［6］，Tan 等［7］也發(fā)現(xiàn)5種胰腺癌細(xì)胞株高水平表達(dá)誘導(dǎo)凋亡的DR4 和DR5。吉西他濱是近年研制的新型嘧啶類似物，它的出現(xiàn)使胰腺癌的化療取得了突破性的進(jìn)展，Oettle 等［8］進(jìn)行了一項對比吉西他濱和5-Fu 的Ⅲ期臨床研究，結(jié)果顯示，吉西他濱單藥化療在臨床獲益和生存期方面，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的5-Fu。因此，吉西他濱被美國FDA 批準(zhǔn)為胰腺癌治療中的金標(biāo)準(zhǔn)化療藥［9-10］。

本研究中，我們將能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail 及吉西他濱聯(lián)合，并共同作用于胰腺癌細(xì)胞，通過研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組、重組質(zhì)粒組及吉西他濱組SW1990 細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡，且聯(lián)合組凋亡率均顯著高于其他兩組。提示重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail 與吉西他濱聯(lián)合具有協(xié)同作用，并能更有效促進(jìn)SW1990 胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

但是，本研究在深度及廣度上還需繼續(xù)改善，并計劃進(jìn)一步在胰腺癌的裸鼠模型中評價其安全性和有效性。

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