白樺脂酸聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

·基礎(chǔ)研究·

白樺脂酸聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2242.006.html

孫嘉1**， 馬丹2， 王萍2， 方琴3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 血液科， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽550014)

[摘要]目的： 探討白樺脂酸(BA)聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤(MM)U266細(xì)胞凋亡及其機(jī)制。方法：用不同濃度的BA(20、40、60及80 mg/L)、硼替佐米(10、80及320 nmol/L)、40 mg/L BA分別聯(lián)合10、80及320 nmol/L硼替佐米(聯(lián)合1～3組)處理U266細(xì)胞，MTT法檢測(cè)上述各組U266細(xì)胞增殖抑制率；Real-time PCR和蛋白免疫印跡法(Western blot)分別檢測(cè)40 mg/L BA、80 nmol/L硼替佐米及40 mg/L BA聯(lián)合80 nmol/L硼替佐米(聯(lián)合4組)的U266細(xì)胞Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax的 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：聯(lián)合1～3組對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制率顯著高于BA組和硼替佐米組(P<0.05)；與硼替佐米組和BA組相比，聯(lián)合4組U266細(xì)胞的cyto-C,Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而Survivin、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：BA聯(lián)合硼替佐米可以促進(jìn)MM腫瘤細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與下調(diào)Survivin、Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Cyto-c、Bax表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]白樺脂酸； 硼替佐米； U266細(xì)胞； 凋亡； 基因表達(dá)

[基金項(xiàng)目]*國家自然科學(xué)基金(No:81360501)**貴州醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)碩士研究生***通信作者 E-mail:47420755@qq.com

[中圖分類號(hào)]R733.3； R34-33

Research on Betulinic Acid Combined with Bortezomib

Inducing U266 Cell Apoptosis and Its mechanism

SUN Jia1, MA Dan2, WANG Ping2, FANG QIN3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofHematology,Affiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofPharmacy,

BaiyunHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550014,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate betulinic acid combined with bortezomib inducing apoptosis of multiple myeloma (MM) U266 cells and its mechanism. Method:U266 cells were treated with betulinic acid(20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg/L, 80 mg/L), bortezomib (10 nmol/L, 80 nmol/L,320 nmol/L), BA(40 mg/L) combined with 10 nmol/L, 80 nmol/L, 320 nmol/L bortezomib (combination 1～3 groups). The proliferation inhibition rate of U266 cells was detected by MTT assay; Real-time PCR and Western blot were applied to detect mRNA and protein expression levels of Survivin, Cyto C, of BCL-2 and Bax in 40 mg/L BA group, 80 nmol/L bortezomib group and 40 mg/L BA combined with 80 nmol/L bortezomib group. Results: Proliferation inhibition rate of U266 cells in combination 1～3 groups was significantly higher than that in BA group and bortezomib group (P<0.05); compared with BA group and bortezomib group, mRNA and protein expression levels of Cyto C，Bax in the combination 4 group were remarkably increased (P<0.05), the Survivin, Bcl-2 mRNA and protein expression levels were significantly decreased (P<0.05). Conclusions: The betulinic acid combined with bortezomib is proved to induce apoptosis of MM cells and its mechanism may be associated with the down-regulation of Survivin, BCL-2 and up-regulation of Cyto-c, Bax expression levels.

[Key words] betulinic acid; borezomib; U266 cells; apoptosis; gene expression

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是多發(fā)于中老年的惡性血液腫瘤之一，是發(fā)生在B淋巴細(xì)胞終末階段的惡性漿細(xì)胞病變[1-3]。近年來，臨床上多采用以硼替佐米或來那度胺為基礎(chǔ)的化療方案，聯(lián)合環(huán)磷酰胺、阿霉素等藥物進(jìn)行誘導(dǎo)化療，但因MM是不可治愈性疾病，需長期治療[4-5]。白樺脂酸(Betulinic Acid，BA)作為一種從五環(huán)三萜類化合物，具有顯著的抗炎、抗HIV、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[6-7]，可誘導(dǎo)白血病、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞卻沒有殺傷力[8-9]。BA聯(lián)合硼替佐米對(duì)MM細(xì)胞株U266細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚[10]，本研究采用BA聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)U266細(xì)胞的凋亡，探討其凋亡的可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

人MM細(xì)胞 U266(獲贈(zèng)于湘雅醫(yī)學(xué)院附屬第2醫(yī)院血液科)。BA購于Alexis公司，硼替佐米購自美國Millennium公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于Gibco公司；β-actin、Survivin、BCL-2、Bax及Cyto-c單克隆抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT購于美國AxyPrep公司，PrimeScriptTMRT reagent KIT、SYBR Premix Ex TapTM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)U266細(xì)胞接種于含15%的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) U266細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，分別用BA(20、40、60及80 mg/L)、硼替佐米(10、80及320 nmol/L)和40 mg/L BA分別聯(lián)合10、80及320 nmol/L硼替佐米(聯(lián)合1～3組)處理U266細(xì)胞，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(BA組分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h，硼替佐米組和聯(lián)合1～3組培養(yǎng)48 h)，然后每孔加入5 g/L MTT溶液10 uL，繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，并用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。根據(jù)增殖抑制率和濃度計(jì)算藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%的濃度(IC50)值，IC50=lg-1[Xm-I(ΣP-0.5)](Xm,設(shè)計(jì)的最大藥物濃度的對(duì)數(shù)值；I,各濃度倍比濃度的對(duì)數(shù)值；ΣP,各組生長抑制率之和；0.5為經(jīng)驗(yàn)常數(shù))，根據(jù)IC50值求得最適濃度。以BA和硼替佐米最適濃度及二者聯(lián)合分別處理U266細(xì)胞48 h后進(jìn)行Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。

1.2.3檢測(cè)Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax mRNA 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)法，分別取對(duì)照組、BA(40 mg/L)組、硼替佐米(80 nmol/L)組及40 mg/L BA聯(lián)合80 nmol/L硼替佐米(聯(lián)合4組)U266細(xì)胞，用AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT試劑盒提取細(xì)胞總RNA；按PrimeScriptTMRT reagent KIT和SYBR Premix Ex TapTM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒說明書分別進(jìn)行cDNA的合成和Real-time PCR反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。各基因引物序列見表1。

表1　Survivin、BCL-2 、Bax、 Cyto-C及β-actin引物序列

1.2.4檢測(cè)Survivin，Cyto-C，BCL-2，Bax蛋白表達(dá) 采用Western blot法，按照1.2.3方法取U266細(xì)胞，加入了細(xì)胞裂解液后冰上孵育30 min，超聲粉碎儀進(jìn)行超聲粉碎。4 ℃ 12 000 rm/min離心20 min，取少量上清以Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg 蛋白經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，PVDF 膜經(jīng)封閉液室溫封阻1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè)蛋白表達(dá)。并用β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1BA、硼替佐米及BA聯(lián)合硼替佐米對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響

單用BA和硼替佐米處理U266細(xì)胞隨著藥物的濃度增加增殖抑制率顯著升高，且BA還隨處理時(shí)間的延長也增強(qiáng)，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05);而硼替佐米組增殖抑制率明顯高于聯(lián)合1～3組(P<0.05)；BA處理U266細(xì)胞24、48及72 h的IC50值分別為(76.27±1.83)、(42.80±2.18)及(29.64±2.53)mg/L，3者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；硼替佐米組IC50值為(69.71±2.82)nmol/L，根據(jù)IC50計(jì)算出BA和硼替佐米作用于U266細(xì)胞最適濃度分別為40和80 nmol/L。見圖1。

2.2檢測(cè)Survivin、Cyto-c、BCL-2及Bax mRNA 和蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，單用BA組或硼替佐米組 Survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，Cyto-C、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與BA組和硼替佐米組比較，聯(lián)合4組Cyto-C和Bax的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，Survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。見圖2、圖3。

圖1　BA、硼替佐米及BA聯(lián)合硼替佐米對(duì)U266細(xì)胞增殖抑制的影響. Fig .1　The inhibitory effects of BA, bortezomib and BA combined with bortezomib on proliferation of U266 cells.

3討論

MM是骨髓漿細(xì)胞惡性疾病，臨床上沙利多胺、馬法蘭等化療藥物均作為治療MM首選藥[11]。目前大多數(shù)MM患者的壽命得以延長，生活質(zhì)量提高，但MM的化療效果不持久易復(fù)發(fā)、易產(chǎn)生耐藥性、副作用多等因素在臨床治療中仍難以攻克[12-13]。在本研究中，分別單用BA、硼替佐米以及BA聯(lián)合硼替佐米共同處理體外培養(yǎng)的U266細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單用BA或硼替佐米處理U266細(xì)胞，隨著藥物的濃度增加增殖抑制率顯著升高，且BA還隨處理時(shí)間的延長也增強(qiáng)對(duì)U266細(xì)胞的增長抑制率(P<0.05)，但單用硼替佐米硼替佐米組可能由于耐藥導(dǎo)致增殖抑制率明顯低于BA聯(lián)合硼替佐米用藥組，這提示BA聯(lián)合硼替佐米用藥可以誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，為臨床治療MM疾病提供了新的治療思路。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療研究中的一項(xiàng)重要課題。通過信號(hào)通路激活或抑制，使細(xì)胞產(chǎn)生一些凋亡蛋白，并具有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖和凋亡能力，如BCL-2、Bax、Cyto-c等。本實(shí)驗(yàn)研究表明，單用硼替佐米組或BA組Survivin、 BCL-2的mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，而Cyto-C，Bax mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，同時(shí)聯(lián)合組較單用硼替佐米組和BA組Cyto-C和Bax mRNA及蛋白表達(dá)也顯著升高，Survivin，BCL-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，提示經(jīng)BA聯(lián)合硼替佐米處理U266細(xì)胞后，可以上調(diào)Cyto-C、Bax基因表達(dá)水平，下調(diào)Survivin、Bcl-2基因表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長，說明BA聯(lián)合抗腫瘤藥物誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡可能是通過上調(diào)促凋亡因子的表達(dá)及下調(diào)抗凋亡因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

(1)與對(duì)照組相比，P<0.05； (2) 與BA組相比，P<0.05； (3)與硼替佐米組相比，P<0.05 圖2　處理后U266細(xì)胞中Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA表達(dá)水平 Fig. 2　Effect of betulinic acid combined with bortezomib on the mRNA expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax

A為對(duì)照組， B為BA組，C為硼替佐米組，D為聯(lián)合4組 (1)與對(duì)照組相比，P<0.05； (2) 與BA組相比，P<0.05； (3)與硼替佐米組相比，P<0.05 圖3　處理后U266細(xì)胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2的mRNA及Bax蛋白表達(dá)水平 Fig. 3　Effect of betulinic acid combined with bortezomib on mRNA levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，and protein levels of Bax.

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(2015-05-22收稿，2015-07-30修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

中醫(yī)古代文獻(xiàn)的引用規(guī)范

中醫(yī)論著中或多或少會(huì)引用中醫(yī)古代文獻(xiàn)的內(nèi)容，因其特殊性，現(xiàn)總結(jié)如下：

1.中醫(yī)古代文獻(xiàn)原則上應(yīng)引用第一手材料，即單行本，古代的一些類書、叢書，如《醫(yī)部全錄》《徐氏醫(yī)書八種》，多為后人所集，非原著者所撰，容易有抄寫之誤，盡量不選。

2.引用時(shí)盡量選用最早的或?qū)W術(shù)界公認(rèn)最好的版本，如《素問》以選趙開美的本子為宜，以防以訛傳訛，并要整句引用，不可斷章取義，以免產(chǎn)生誤解。

3.書名要注意寫全稱，以免混淆。如《備急千金藥方》不能寫成《千金方》，是為了與孫思邈的《千金翼方》區(qū)別。

4.引用中醫(yī)文獻(xiàn)的出處(也稱書證)要列到2級(jí)或3級(jí)，要視書的規(guī)模和標(biāo)題層次而定，原則是便于讀者查找原文，如《濟(jì)陰綱目·調(diào)經(jīng)門·脈法》；但其中“卷”、“篇”會(huì)因書的版本不同而不盡相同，所以不作為一級(jí)的單位。

5.引用文獻(xiàn)中的計(jì)量單位多與現(xiàn)代用法不同，如斤、兩、錢、匕、字等，即使“克”，古代用量也與現(xiàn)代不同。為安全起見，應(yīng)依據(jù)《量和單位》、《中華人民共和國藥典》等國家標(biāo)準(zhǔn)折合成克，并在括號(hào)中注明。

《貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》編輯部