正交型發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測器的研制

（北京理工大學(xué)，北京100081）

熒光檢測技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，其中激光誘導(dǎo)熒光檢測器（laser induced fluorescence detection，LIFD）采用方向性和單色性能極佳的激光作為激發(fā)光源，能夠達(dá)到超高的檢測靈敏度（10－13mol·L－1）［1］。在基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品分析中，只有自發(fā)熒光或熒光衍生化的物質(zhì)能夠產(chǎn)生熒光信號，可以有效降低甚至消除基質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，具有很高的選擇性。

然而，激光誘導(dǎo)熒光檢測器的小型化對于研究人員來說卻是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。商品化儀器主要用傳統(tǒng)的氣體激光器，具有價(jià)格昂貴、體積大、功耗高的缺點(diǎn)［2］，嚴(yán)重限制其廣泛應(yīng)用，半導(dǎo)體激光器的采用使這一情況有所改善，但并未從根本上解決這一問題。另外，為了降低背景噪聲，提高檢測靈敏度，常規(guī)激光誘導(dǎo)熒光檢測裝置都配備了復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致其體積非常龐大，也很難滿足小型化的要求，因此，采用低功耗的激發(fā)光源并簡化光路設(shè)計(jì)已經(jīng)受到越來越多研究人員的重視。近年來，一些低功耗、小型化的激發(fā)光源逐漸應(yīng)用到了熒光檢測中［3－6］。發(fā)光二極管（lightemitting diode，LED）具有價(jià)格低、功耗低、體積小、可選波長范圍寬、壽命長等優(yōu)點(diǎn)［2，7－9］，可以實(shí)現(xiàn)儀器微型化和廉價(jià)化，在諸多研究中已經(jīng)得到應(yīng)用。在光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)化方面，光纖扮演了重要的角色，具有數(shù)值孔徑大、柔韌性好、可以使光線進(jìn)行曲線傳播等特點(diǎn)，代替復(fù)雜的透鏡組，使得儀器變得非常簡潔、緊湊［2，9－14］。LED 作為一種非相干光源，具有很大的發(fā)散角，而通常選用的光纖直徑多為幾百甚至幾十微米，因此提高LED 發(fā)散光與光纖的耦合效率是提高檢測靈敏度的關(guān)鍵。為了降低柱外效應(yīng)的影響，檢測器的檢測池通常在微升或納升級別，對于小型分析系統(tǒng)來說則需要更小的體積，這就對光纖與檢測池的耦合以及裝配精度提出了極高的要求，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)微小的偏差都可能導(dǎo)致檢測靈敏度顯著下降。

作者報(bào)道了一種體積小、功耗低、裝配簡單的小型LED 誘導(dǎo)熒光檢測器，采用正交型光學(xué)系統(tǒng)，以LED作為激發(fā)光源，研制了高精度加工的光纖－毛細(xì)管自校準(zhǔn)平臺以及光電轉(zhuǎn)換和信號采集模塊，基于Lab－VIEW 圖形化編程語言開發(fā)了上位機(jī)程序。以熒光素鈉為目標(biāo)化合物，對檢測器性能進(jìn)行了評價(jià)，優(yōu)化了氨基酸的衍生化方法，并進(jìn)行了異硫氰酸熒光素（FITC）衍生化氨基酸的分離檢測。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

熒光素鈉，分析純，北京拜爾迪生物公司；硼酸、硼砂，分析純，北京化學(xué)試劑公司；甲醇，色譜純，Sigma；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

RIGOL L－3000型高效液相色譜儀；LED（LXmL－PR01－0225，中心發(fā)射波長465～470nm，5 V，700 mA），鈞智科技有限公司；R－003型準(zhǔn)直透鏡，昴氏（上海）電子貿(mào)易有限公司；H5784型光電倍增管，濱松光子學(xué)商貿(mào)（中國）有限公司；多模光纖（N.A＝0.29，芯徑100μm，外徑140μm），北京星源奧特光電技術(shù)有限公司；濾光片（sp485短通濾光片和lp515長通濾光片），北京京儀博電光學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司；47－221型光纖準(zhǔn)直器，愛特蒙特（深圳）光學(xué)有限公司。

1.2 正交型LED誘導(dǎo)熒光檢測器的研制

1.2.1 光路設(shè)計(jì)

檢測器采用正交型光路設(shè)計(jì)，如圖1所示。

圖1 正交型光路結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of orthogonal optical arrangement

LED 的散射光經(jīng)準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直成平行光，由光纖準(zhǔn)直器耦合進(jìn)入100μm 芯徑的多模光纖，并傳導(dǎo)至檢測窗口，射入作為檢測池的100μm 內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管中。激發(fā)的熒光由垂直方向的熒光透鏡收集，經(jīng)過長通濾光片濾去波長小于510nm 的雜散光，最終到達(dá)光電倍增管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換。為避免激發(fā)光進(jìn)入光電倍增管造成背景水平升高，在光纖準(zhǔn)直器之前和熒光收集透鏡之后分別配置了短通和長通濾光片。

1.2.2 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)

(1) 微網(wǎng)運(yùn)行控制技術(shù) 與傳統(tǒng)的電力系統(tǒng)控制技術(shù)不同,微網(wǎng)側(cè)重并、離網(wǎng)控制技術(shù)(分布式電源控制技術(shù)有下垂控制技術(shù)、v/f控制技術(shù)、p/v控制技術(shù))。此外,微網(wǎng)整體運(yùn)行控制也是微網(wǎng)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和趨勢。

研制的LED 誘導(dǎo)熒光檢測器采用模塊化設(shè)計(jì)，主要包括LED 光纖光源、光纖－毛細(xì)管自校準(zhǔn)平臺、信號采集卡和上位機(jī)程序。圖2為集成的正交型LED 誘導(dǎo)熒光檢測器原理樣機(jī)。

1.2.2.1 LED 光纖光源設(shè)計(jì)（圖3）

光纖光源主要包括：高亮度LED 燈及其配套的準(zhǔn)直透鏡，二者通過LED 電路板的定位孔安裝在一起。連接件中安裝有短通濾光片，通過螺紋與外殼裝配，并將LED 燈與準(zhǔn)直透鏡固定在外殼中。準(zhǔn)直透鏡一端安裝在連接件的上端，另一端連接SMA 接口的多模光纖。LED 光纖光源外殼為散熱性能良好的鋁制材料，LED 電路板采用鋁基板，可將LED 燈產(chǎn)生的熱量散發(fā)到外界環(huán)境，保持LED 燈發(fā)光功率的穩(wěn)定。

圖2 正交型LED誘導(dǎo)熒光檢測原理樣機(jī)Fig.2 Principle prototype of LED induced fluorescence detector based on orthogonal optical arrangement

圖3 LED光纖光源結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Structure diagram of LED fiber light source

1.2.2.2 光纖－毛細(xì)管自校準(zhǔn)平臺設(shè)計(jì)（圖4）

采用高精度機(jī)械加工，在平臺上形成2條截面為U 型的定位槽（圖4a），基準(zhǔn)軸2和3所指的定位槽分別放置毛細(xì)管（外徑375μm）和光纖（外徑140μm），深度分別為285μm 和170μm，底部圓形直徑分別為375μm 和140μm；基準(zhǔn)軸1為垂直方向的熒光收集透鏡中心軸。放置于對應(yīng)定位槽內(nèi)的光纖和毛細(xì)管與U 型槽的圓形底部完全匹配，并且二者的中心軸互相垂直相交于f點(diǎn)（圖4b），f點(diǎn)也是熒光收集透鏡的焦點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)光纖－毛細(xì)管的自校準(zhǔn)，同時(shí)使熒光檢測窗口處于熒光收集透鏡的焦點(diǎn)位置，在不使用輔助校準(zhǔn)設(shè)備的前提下，實(shí)現(xiàn)三者中心軸互相垂直相交，達(dá)到最佳的熒光激發(fā)和收集效率。

1.2.2.3 信號采集卡設(shè)計(jì)

硬件電路主要包括LED 燈和PMT 供電電源模塊、熒光信號采集模塊和RS232串口通訊模塊，其中熒光信號采集模塊最為重要。本設(shè)計(jì)采用模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片AD7734將光電倍增管傳輸?shù)哪M信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，由微處理器MSP430F449 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過RSR232串口與上位機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸。

本設(shè)計(jì)基于LabVIEW 圖形化編程語言編寫了用于數(shù)據(jù)顯示和處理的工作站軟件，包括兩大模塊：在線數(shù)據(jù)采集模塊和離線數(shù)據(jù)分析模塊。其中在線數(shù)據(jù)采集模塊可以進(jìn)行串口配置、數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)采集與顯示、數(shù)據(jù)保存；離線數(shù)據(jù)分析模塊可以進(jìn)行歷史數(shù)據(jù)載入、數(shù)據(jù)處理并生成報(bào)表。

圖4 光纖－毛細(xì)管自校準(zhǔn)平臺及激發(fā)部位結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Self－calibration platform of optical fiber and capillary tube and structure diagram of excitation part

1.3 檢測器性能測試

以熒光素鈉為目標(biāo)化合物，通過自動(dòng)進(jìn)樣器將熒光素鈉引入流路，由液相色譜泵驅(qū)動(dòng)進(jìn)入檢測池（由于只需測定檢測性能，并未涉及到分離，所以未連接色譜柱）。流動(dòng)相：20×10－6mol·L－1硼酸鹽緩沖溶液（pH 值9.37）；流速：1mL·min－1；進(jìn)樣量：20μL。

1.4 氨基酸分離檢測

色譜條件：RIGOL L－3000型高效液相色譜系統(tǒng)，Diamonsil C18反相色譜柱，進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相為甲醇－硼酸鹽緩沖溶液（pH 值9.37）（30∶70，體積比）。

氨基酸衍生化和HPLC 分離檢測：在避光條件下，取100μL甘氨酸溶液置于10mL容量瓶中，加入適量的FITC溶液，振蕩混勻，用pH 值為9.37 的硼酸鹽緩沖溶液定容至10mL，在特定溫度下孵育一定時(shí)間，待用。

將衍生化的氨基酸進(jìn)行HPLC 分離檢測，在每次實(shí)驗(yàn)完成后調(diào)整流動(dòng)相比例為80%甲醇將未洗脫的FITC沖出再進(jìn)行下一次分析。由于FITC 與氨基酸必須在高濃度下反應(yīng)才能得到較高的產(chǎn)率，在進(jìn)行高效液相色譜分析前，需要對樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用0.22μm濾膜過濾后再進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器性能測試結(jié)果

2.1.1 溶液pH 值對熒光素鈉熒光強(qiáng)度的影響

熒光素鈉作為黃綠光區(qū)中的一種熒光染料，具有較高的能量轉(zhuǎn)換效率，并且其熒光強(qiáng)度與其溶液的pH 值直接相關(guān)，因此在測試熒光檢測器性能前有必要對溶液pH 值與熒光素鈉熒光轉(zhuǎn)換效率的關(guān)系進(jìn)行考察。采用流動(dòng)注射模式，在不同pH 值流動(dòng)相條件下對1×10－7mol·L－1的熒光素鈉進(jìn)行檢測，記錄其色譜峰面積（n＝5），結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同pH 值下熒光素鈉的熒光響應(yīng)Fig.5 Fluorescent response of sodium fluorescence at different pH values

由圖5可以看出：在酸性和弱堿性環(huán)境中，熒光素鈉產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較低；隨著pH 值的增大，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在pH 值為9.37 時(shí)達(dá)到最強(qiáng)；但是當(dāng)pH值增大到10以后，熒光強(qiáng)度呈減弱趨勢。

2.1.2 性能測試

配制系列濃度的熒光素鈉溶液，采用流動(dòng)注射模式，在同一實(shí)驗(yàn)條件下分別進(jìn)樣5次，進(jìn)行性能測試，得到最低檢測量為1.02ng、最低檢測限為6.75×10－8mol·L－1（S／N＝3），檢測系統(tǒng)在1.35×10－7～43.2×10－7mol·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y＝0.1525x－15.669，R2＝0.9992。

圖6為1.35×10－7mol·L－1熒光素鈉的HPLC圖譜。

圖6 1.35×10－7 mol·L－1熒光素鈉的HPLC圖譜Fig.6 HPLC of 1.35×10－7 mol·L－1 sodium fluorescence

2.2 檢測器穩(wěn)定性測試結(jié)果

分別將熒光素鈉供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰，以峰面積考察檢測器穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。

表1 LED誘導(dǎo)熒光檢測器的穩(wěn)定性測試結(jié)果Tab.1 Stability testing results of LED induced fluorescence detector

由表1可知，RSD 值小于1，表明該檢測器穩(wěn)定性良好。

2.3 氨基酸衍生化條件的選擇

2.3.1 FITC與氨基酸物質(zhì)的量比對衍生化的影響

FITC與氨基酸物質(zhì)的量比是影響衍生物產(chǎn)率的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)選用甘氨酸（Gly）與FITC 反應(yīng)來考察不同物質(zhì)的量比對衍生反應(yīng)的影響，將FITC溶液與甘氨酸溶液分別按物質(zhì)的量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1、10∶1混合，室溫下避光反應(yīng)24h后進(jìn)行高效液相色譜檢測，以FITC－Gly衍生產(chǎn)物峰面積對FITC 與甘氨酸物質(zhì)的量比作圖，結(jié)果見圖7。

圖7 FITC與甘氨酸物質(zhì)的量比對衍生化的影響Fig.7 Effect of the molar ratio of FITC to Gly on derivatization

由圖7可以看出，F(xiàn)ITC與甘氨酸物質(zhì)的量比從1∶1增大到5∶1時(shí)，峰面積逐漸增大，繼續(xù)增大物質(zhì)的量比，峰面積變化很小。因此，選擇最佳的FITC 與氨基酸的物質(zhì)的量比為5∶1。

2.3.2 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對衍生化的影響

化學(xué)反應(yīng)速率除與反應(yīng)物本身的性質(zhì)相關(guān)外，外界因素（如溫度、濃度、催化劑等）也會對其產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對衍生化反應(yīng)的影響。按照FITC與甘氨酸物質(zhì)的量比5∶1配制反應(yīng)液，采用高效液相色譜法在特定時(shí)間測定FITCGly衍生產(chǎn)物的峰面積，以不同溫度的峰面積對時(shí)間作圖，結(jié)果見圖8。

圖8 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對衍生化的影響Fig.8 Effects of reaction temperature and reaction time on derivatization

由圖8可以看出：0 ℃和20 ℃下的FITC－Gly衍生產(chǎn)物峰面積遠(yuǎn)小于37 ℃和60 ℃；37 ℃和60 ℃下最終的衍生產(chǎn)物的峰面積相差不大；60 ℃反應(yīng)4h，衍生產(chǎn)物的峰面積就可以達(dá)到最大值，而37℃需要反應(yīng)24h?？紤]到FITC 在較高溫度下穩(wěn)定性較差，副產(chǎn)物增多，選擇37 ℃孵育。

2.4 衍生化氨基酸的分離

采用高效液相色譜法分離4種FITC 衍生化的氨基酸，實(shí)驗(yàn)分別采用3種流動(dòng)相甲醇－水（20∶80）、甲醇－磷酸鹽緩沖溶液（10×10－6mol·L－1，pH 值為8.0）（30∶70）和甲醇－硼酸鹽緩沖溶液（10×10－6mol·L－1，pH 值為9.37）（30∶70）進(jìn)行等濃度洗脫，分離衍生化氨基酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用甲醇－硼酸鹽緩沖溶液作流動(dòng)相，衍生化的氨基酸與游離FITC 可以得到基線分離，如圖9所示。

3 結(jié)論

研制了一臺基于正交型光路設(shè)計(jì)的LED 誘導(dǎo)熒光檢測器，以LED 代替激光器作為激發(fā)光源，在光學(xué)系統(tǒng)中引入光纖代替透鏡組，使整機(jī)的體積和功耗大大降低。采用流動(dòng)注射模式，以熒光素鈉為目標(biāo)化合物對檢測器進(jìn)行了性能評價(jià)。結(jié)果表明，該熒光檢測器靈敏度和線性范圍可以滿足常規(guī)檢測需要，相對于常規(guī)激光誘導(dǎo)熒光檢測器，具有小型化、成本低、光學(xué)結(jié)構(gòu)簡單的特點(diǎn)，易于裝配和使用。

圖9 衍生化氨基酸的分離Fig.9 Separation of derivative amino acids

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