低溫乳酸菌發(fā)酵泡白菜工藝與品質(zhì)分析*

韓新鋒，李小艷，黃道梅，賈秋思，胡露，胡欣潔，何利，劉書亮

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)2(農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安，625014)

泡菜是我國一種以乳酸菌發(fā)酵為主并具有多種保健功能的食品。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作為中溫型微生物，一般在低于15℃的條件下很難生長，目前為止多數(shù)乳酸菌為常溫下分離所得，泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)一般使用的菌劑也多以常溫發(fā)酵為主［1-3］，其發(fā)酵周期短易過酸和過熟，然而生產(chǎn)上蔬菜的收獲和鹽漬也多集中在冬季，常溫乳酸菌對(duì)泡菜的發(fā)酵速度過慢從而限制了工業(yè)化生產(chǎn)。另外，蔬菜表面的附生微生物中部分為致腐菌甚至可能存在致病菌，在泡菜發(fā)酵前期可能生長繁殖影響泡菜的安全性和品質(zhì)，所以常用12%以上鹽度進(jìn)行控制。耐低溫乳酸菌的應(yīng)用，不僅可以解決這一生產(chǎn)問題，而且在一定程度上可以抑制泡菜中雜菌的生長，減少敗壞，降低亞硝酸鹽含量，保持獨(dú)特的口感和風(fēng)味［4］。迄今為止，關(guān)于低溫乳酸菌在泡菜中應(yīng)用的研究還不多見，Choi等［5］從15℃下發(fā)酵的泡菜中分離到Leuconostoc citreum，并將其接種于泡菜在15℃條件下發(fā)酵，研究了其產(chǎn)酸情況，余文華等［6］研究了耐低溫乳酸菌接種于泡菜在7℃條件下發(fā)酵的產(chǎn)酸及亞硝酸鹽降解情況，然而在低溫條件下，低溫乳酸菌接種泡菜發(fā)酵的工藝及品質(zhì)分析這一領(lǐng)域的研究還很薄弱。

本文以2株耐低溫乳酸菌3m-1(Lactobacillus plantarum)和8m-9(Leuconostoc mesenteroides)為研究對(duì)象，10℃條件下，拮抗試驗(yàn)確定了菌株間無拮抗作用，適于混合發(fā)酵泡白菜，并確定了白菜發(fā)酵的最適菌株配比、工藝條件及發(fā)酵時(shí)間，比較了10℃和30℃條件下泡菜成品的理化、微生物及感官指標(biāo)，為低溫泡菜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株:通過限制低溫(10℃)培養(yǎng)條件，經(jīng)過產(chǎn)酸能力測試、低溫測試復(fù)篩及低溫乳酸菌界定后，從泡菜水中分離得到2株耐冷菌株，經(jīng)系統(tǒng)鑒定菌株3m-1為植物乳桿菌(L.plantarum)，菌株8m-9為腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)。以上菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、白菜汁培養(yǎng)基［7］、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

主要試劑:蛋白胨等均為生化試劑(BR);檸檬酸氫二銨等均為分析純(AR)。

泡菜原料:白菜、芹菜、花椒等均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兩株耐低溫乳酸菌間的拮抗試驗(yàn)

定量以100 μL/孔加入菌株3m-1(或8m-9)的發(fā)酵上清液(10℃下于白菜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h)于含有菌株8m-9((或3m-1)106CFU/mL)的牛津杯雙層瓊脂法制備的檢測平板［8］，同時(shí)設(shè)重復(fù)，4℃冰箱擴(kuò)散1 h后，10℃正置培養(yǎng)96 h，觀察有無抑菌圈出現(xiàn)，初步確定菌株間的拮抗作用。

將活化菌株3m-1和8m-9，接種于白菜汁培養(yǎng)基，10℃混合培養(yǎng)120 h，每12 h取樣，測定發(fā)酵液活菌數(shù)，以菌株3m-1和8m-9單獨(dú)接種于白菜汁培養(yǎng)基為對(duì)照［9］，進(jìn)一步確定菌株間有無拮抗作用。

1.2.2 泡菜發(fā)酵工藝路線

1.2.3 菌株配比的篩選

共分為6組進(jìn)行篩選，第1組為自然發(fā)酵對(duì)照組，第2組和第3組為菌株3m-1、8m-9單獨(dú)接種發(fā)酵組，第4組至第6組為菌株3m-1和8m-9按照1∶1、1∶2、2∶1比例復(fù)配接種發(fā)酵組。將上述各組在10℃下發(fā)酵，每24 h取樣測定pH值、總酸和亞硝酸鹽含量，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定發(fā)酵菌株及其配比。

1.2.4 10℃條件下耐低溫乳酸菌最適配比接種發(fā)酵泡白菜工藝條件的優(yōu)化

選擇鹽濃度(3%、4%、5%)、糖濃度(2%、4%、6%)、接種量(0.1%、0.2%、0.3%)3因素3水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，定期取樣測定pH值，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定泡菜的最佳工藝參數(shù)。

1.2.5 10℃和30℃下泡白菜成品品質(zhì)特性的比較

按上述步驟確定菌株配比及最佳工藝參數(shù)，分別在10℃和30℃下發(fā)酵，比較發(fā)酵終點(diǎn)泡菜成品的感官、理化及微生物指標(biāo)。

1.2.6 感官評(píng)價(jià)

邀請10名具有食品專業(yè)背景的研究生組成評(píng)定小組依據(jù)表1對(duì)泡菜的形態(tài)、色澤、口感、口味、氣味、脆度進(jìn)行感官評(píng)定(總體得分=形態(tài)×10%+色澤×10%+氣味×20%+口味×30%+脆度×30%)。

表1 發(fā)酵泡白菜感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表［10－12］Table 1 Sensory evaluation standard of pickled Chinese cabbage

1.2.7 理化指標(biāo)的測定

pH值的測定:采用精密pH計(jì)測定發(fā)酵過程中泡菜pH值。

總酸的測定:參照GB/T 12456-2008采用酸堿中和法測定。

亞硝酸鹽的測定:參照GB 5009.33-2010采用鹽酸萘乙二胺法測定。

鹽度的測定:參照GB/T 5009.51-2003采用Ag-NO3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法測定。

還原糖的測定:參照GB/T5009.7-2008采用直接滴定法測定。

1.2.8 微生物指標(biāo)的測定

菌落總數(shù)計(jì)數(shù):參照GB 4789.2-2010方法測定。

大腸菌群的測定:按照GB 4789.3-2003方法測定。

乳酸菌數(shù)的測定:參照GB 4789.35-2010方法測定。

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù):參照GB 4789.15-2010方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株耐低溫乳酸菌間的拮抗試驗(yàn)

10℃條件下，菌株3m-1和8m-9間的抑菌試驗(yàn)無抑菌圈出現(xiàn)，初步確定菌株間無拮抗作用。為了證實(shí)抑菌試驗(yàn)的可靠性，比較了菌株3m-1和8m-9在白菜汁培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)以及混合培養(yǎng)的活菌數(shù)(圖1)。菌株3m-1和8m-9混合培養(yǎng)時(shí)生長情況良好，活菌數(shù)在60 h時(shí)即達(dá)到109cfu/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與抑菌試驗(yàn)結(jié)果一致，菌株3m-1和8m-9之間無拮抗作用，可以混合搭配用于發(fā)酵泡白菜。

圖1 菌株3m-1和8m-9在白菜汁培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的活菌數(shù)動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Enumeration of viable plate count of LAB in Chinese cabbage extract medium inoculated alone or simultaneously with LAB strains of 3m-1 and 8m-9

2.2 菌株間配比的確定

接種有菌株8m-9的泡白菜前5天產(chǎn)酸速度快(P＜0.05)，后期產(chǎn)酸量小而慢(P＜0.05)，不易過酸而影響口感;接種有菌株3m-1的泡白菜后期產(chǎn)酸快且量大，發(fā)酵15 d pH值降到3.60左右，總酸含量達(dá)到0.40%左右，而自然發(fā)酵前2天酸度基本無變化(P＞0.05)(圖2)，發(fā)酵20 d總酸含量只達(dá)到0.22%(圖3)，與楊曉暉等［13］研究結(jié)果一致。不同菌株接種發(fā)酵泡白菜均出現(xiàn)了亞硝峰，自然發(fā)酵泡菜亞硝峰出現(xiàn)在第5天(8.64 mg/kg)，而接種發(fā)酵泡白菜的亞硝峰一般出現(xiàn)在第1天(1.67～2.60 mg/kg)(圖4)，均符合DB 51/T975-2009《四川泡菜》的限量要求。不同的菌株配比對(duì)泡菜的感官評(píng)分有一定的影響，其中組 3(8m-9)和組6(3m-1∶8m-9=2∶1)與其它組有顯著性差異(P＜0.05)，感官評(píng)分最高，特別是在泡菜的氣味、口味和色澤方面有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。綜合考慮，最終選擇菌株8m-9以及菌株3m-1和8m-9以2∶1復(fù)配作為優(yōu)選菌株及配比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同菌株接種發(fā)酵泡白菜的pH動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Variation of pH value in pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strain

圖3 不同菌株接種發(fā)酵泡白菜的總酸含量動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Variation of total acid content in pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strains

圖4 不同菌株接種發(fā)酵泡白菜的亞硝酸鹽含量動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Variation of nitrite content in pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strains

表2 不同菌株單獨(dú)或復(fù)配接種發(fā)酵對(duì)泡白菜感官評(píng)價(jià)的影響Table 2 Sensory evaluation of pickled Chinese cabbage fermented with different LAB strains

2.3 10℃條件下發(fā)酵泡白菜工藝條件的確定

如表3所示，10℃下，8m-9菌株單獨(dú)接種發(fā)酵泡白菜中，3因素對(duì)泡菜品質(zhì)影響順序?yàn)?鹽加量＞糖加量＞接種量，最優(yōu)條件為:4%鹽加量、4%糖加量、0.3%接種量，由于菌株8m-9(L.mesenteroides)為異型發(fā)酵菌，產(chǎn)酸柔和，當(dāng)發(fā)酵13天pH值降到4.00左右時(shí)對(duì)泡菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，當(dāng)發(fā)酵20 d pH降到3.70左右時(shí)感官評(píng)分最高(P＜0.05);菌株3m-1和8m-9以2∶1混合發(fā)酵泡白菜中，3因素對(duì)泡菜品質(zhì)影響順序?yàn)?接種量＞糖加量＞鹽加量，最優(yōu)條件為:5%鹽加量、2%糖加量、0.3%接種量，當(dāng)發(fā)酵5天pH值降到3.80左右時(shí)對(duì)泡菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，當(dāng)發(fā)酵9天pH降到3.60左右時(shí)感官評(píng)分最高(P＜0.05)(表4)。

表3 優(yōu)選菌株接種發(fā)酵泡白菜正交試驗(yàn)表Table 3 Orthogonal experiment for pickled Chinese cabbage fermented with preferred LAB strains

表4 優(yōu)選乳酸菌發(fā)酵泡白菜優(yōu)化工藝的感官評(píng)分結(jié)果Table 4 Sensory evaluation for pickled Chinese cabbage fermented with preferred LAB strains

2.4 10℃和30℃下泡菜成品品質(zhì)特性的比較

10℃和30℃下，以優(yōu)選乳酸菌單獨(dú)或混合發(fā)酵白菜，成品理化、微生物和感官指標(biāo)結(jié)果見表5。10℃下，泡菜酸度和亞硝酸鹽含量明顯低于常溫(P＜0.05)，發(fā)酵周期雖長，但口感清淡風(fēng)味更佳，且防止了泡菜過酸和過熟;10℃下，菌落總數(shù)與乳酸菌數(shù)基本一致(乳酸菌可以于PCA平板上生長)，而且酵母菌數(shù)明顯低于常溫，說明低溫可以抑制雜菌的生長;10℃和30℃下，霉菌 ＜10 CFU/g，大腸菌群 ＜30 CFU/100 g，符合DB 51/T975-2009規(guī)定。

表5 10℃和30℃下泡菜成品理化、微生物和感官指標(biāo)Table 5 Physicochemical and microbial index，sensory evaluation of pickled Chinese cabbage fermented at 10℃and 30℃

3 討論

我國泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)以常溫發(fā)酵為主，而關(guān)于低溫發(fā)酵的研究少見報(bào)道。本文以2株耐低溫乳酸菌3m-1(L.plantarum)和 8m-9(L.mesenteroides)為對(duì)象，在1℃條件下，首先通過拮抗試驗(yàn)確定2株耐低溫菌在白菜汁培養(yǎng)基中無拮抗作用，可以混菌搭配用于發(fā)酵泡白菜;然后確定了發(fā)酵菌株的最佳配比，分別為8m-9單獨(dú)以及3m-1和8m-9以2∶1復(fù)配作為發(fā)酵菌種，傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)多以純菌或混菌接種，產(chǎn)品品質(zhì)也各有不同［14-16］，但兩種乳酸菌同時(shí)接種發(fā)酵泡菜的報(bào)道還不多見;優(yōu)化了組3和組6的工藝條件，分別為鹽加量4%、糖加量4%、接種量0.3%和鹽加量5%、糖加量2%、接種量0.3%，低溫發(fā)酵鹽加量低，口味清淡風(fēng)味柔和飽滿，而常溫發(fā)酵為防止泡菜過酸及抑制雜菌生長，會(huì)加大鹽的添加量，影響了泡菜的口感［17］;微酸、酸化和過酸為泡菜發(fā)酵3階段，酸化期為泡菜的最佳食用期，所以本文在泡菜pH值降到4.00～3.80時(shí)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定菌株8m-9單獨(dú)以及菌株3m-1和8m-9以2∶1復(fù)配發(fā)酵泡白菜的最佳食用pH值分別為3.70和3.60左右，而報(bào)道的研究多對(duì)泡菜整個(gè)發(fā)酵過程(發(fā)酵初期雜菌較多同時(shí)也未能避開亞硝峰)或成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)［18］。

本文比較了10℃和30℃下泡菜成品的理化、微生物和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，常溫發(fā)酵速度快，泡菜易過酸、變味而風(fēng)味不佳;低溫發(fā)酵周期雖長，但不易過酸，風(fēng)味濃厚、飽滿、柔和。四川當(dāng)?shù)厥卟说氖斋@和鹽漬多集中在冬季，企業(yè)在冬季生產(chǎn)泡菜時(shí)，車間溫度一般為10℃左右，選擇此溫度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，更接近生產(chǎn)實(shí)際，也利于對(duì)低溫乳酸菌菌株特性和生產(chǎn)性能進(jìn)行研究。低溫環(huán)境中常溫乳酸菌一般不易生存或生長，生產(chǎn)上為防制蔬菜腐敗常會(huì)增加鹽使用量等措施，從而加大了生產(chǎn)的成本，同時(shí)蔬菜表面附有的微生物部分為致腐菌甚至可能存在致病菌，常溫下發(fā)酵前期會(huì)大量繁殖而影響泡菜的品質(zhì)，耐低溫乳酸菌的應(yīng)用不僅可以解決這一問題，而且為低溫泡菜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

［1］ 蔣和平.四川泡菜袋裝發(fā)酵研究［J］.食品科學(xué)，1994，1(4):39-40.

［2］ 畢金峰，劉長江，孟憲軍.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌的分離、鑒定及發(fā)酵劑的篩選［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31(4):346-349.

［3］ 陸利霞，孫蕓，葛雅，等.直投式發(fā)酵劑制備幾種泡菜的研究［J］.南京曉莊學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，3(3):53-56.

［4］ Rhee S J，Lee J E，Lee C H.Importance of lactic acid bacteria in Asian fermented foods［J］.Microbial Cell Facotries，2011，10(Suppl 1):S5:1-13.

［5］ Choi I K，Jung S H，Kim B J，et al.Novel Leuconostoc citreum starter culture system for the fermentation of kimchi，a fermented cabbage product［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2003，84(4):247-253.

［6］ 余文華，杜丹青，張穎，等.耐低溫乳酸菌發(fā)酵泡菜的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2012，48(6):17-19.

［7］ 吳蕊.泡菜中優(yōu)良乳酸菌的篩選及高效混合菌株發(fā)酵劑研制［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:18-19.

［8］ 敖靈.戊糖乳桿菌C50-6細(xì)菌素的純化和特性研究［D］.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008:21-24.

［9］ 王永霞.肉品發(fā)酵劑的菌種篩選及在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004:32-36.

［10］ 陳功.中國泡菜的品質(zhì)評(píng)定與標(biāo)準(zhǔn)探討［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(2):335-338.

［11］ 劉洪.自然發(fā)酵與人工接種泡菜發(fā)酵過程中品質(zhì)變化規(guī)律的動(dòng)態(tài)研究［D］.成都:西華大學(xué)，2004:25-30.

［12］ 張艾青.產(chǎn)廣譜細(xì)菌素植物乳桿菌的初步研究及其在泡菜中應(yīng)用［D］.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007:60-69.

［13］ 楊曉暉.泡菜中低溫發(fā)酵乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵工藝的研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005:25-51.

［14］ 任俊琦，賀雅非，趙季，等.接種發(fā)酵白菜及其低溫保藏微生物變化規(guī)律［J］.食品工業(yè)科技，2005，26(7):59-61.

［15］ YANG X M，LIU Q M，XU X Y.Effects of fermentation inoculated lactobacillus on quality and nitrite content of Chinese sauerkraut［J］.Journal of Zhejing Agricultural University，2003，29(3):291-294.

［16］ YAN P M，XUE W T，TAN S S，et al.Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting.Chinese paocai［J］.Food Control，2008，19(1):50-55.

［17］ Yoon SS，Arrangou PR，Breid TF，et al.Isolation and characterization of bacteriophages from fermenting sauerkraut［J］.Applied and Environment Microbiology，2002，68(2):973-976.

［18］ 蔣緯，譚書明，陳舟東，等.四種乳酸菌純種發(fā)酵泡椒的研究［J］.中國調(diào)味品，2013，38(4):23-27.