利用酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)提高豬骨泥的功能性*

王帥楠，宗紅，陸信曜，諸葛斌，方慧英，黨藝文，孫進(jìn)，樓笑笑，馮倩

1(江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究室，江蘇無(wú)錫，214122)

3(浙江正味食品有限公司，浙江省調(diào)味食品制造工程技術(shù)研究中心，浙江義烏，322000)

畜禽鮮骨大約占到胴體的10% ～15%，是肉類(lèi)加工業(yè)中一個(gè)非常重要的副產(chǎn)物，隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，畜禽肉類(lèi)產(chǎn)量逐年遞增，其副產(chǎn)物畜禽骨骼的產(chǎn)量也隨之迅速增加，每年有近約2 000萬(wàn)t的畜禽骨頭產(chǎn)生。畜禽骨骼除富含蛋白質(zhì)、脂肪、骨膠原、軟骨素(酸性黏多糖)等營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有多種礦物質(zhì)，如鋅、磷、鈣、鐵等，含量是鮮肉的數(shù)倍，營(yíng)養(yǎng)極為豐富。

目前，對(duì)畜禽骨的加工利用已受到重視。丁小燕［1］等人利用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)雞骨進(jìn)行深度水解，確定了蛋白酶酶解工藝，獲得含有豐富氨基酸的動(dòng)物水解蛋白。Quaglia［2］等人研究表明，采用酶解等方法能夠有效地將骨蛋白與不可溶性殘留成分分開(kāi)，并獲得具有一定功能特性的短肽。秦斌鈺［3］等人利用枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對(duì)豬骨泥進(jìn)行發(fā)酵，使骨蛋白水解度提高到46.1%。利用單一的商品蛋白酶或菌株發(fā)酵水解骨蛋白深度有限，回收利用率不高，骨原料得不到充分利用。

本研究將酶解與發(fā)酵技術(shù)聯(lián)用對(duì)豬骨中的骨蛋白進(jìn)行水解處理，為考察該技術(shù)對(duì)豬骨泥功能性品質(zhì)的影響，對(duì)其可溶性膠原蛋白、可吸收性鈣、小肽、功能性氨基酸、抗氧化活性等進(jìn)行分析，為畜禽骨類(lèi)的功能性開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)F2，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)M1，江南大學(xué)微生物研究中心保藏。

1.1.2 原料與儀器

新購(gòu)新鮮畜骨粗粉經(jīng)高壓蒸煮、烘干、粉碎備用。DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、4-二甲氨基苯甲醛、羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、異硫氰酸苯酯為sigma公司產(chǎn);蛋白酶protexTMP購(gòu)于Genencor;其他試劑為分析純。

MP5002電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠;alltech高效液相色譜儀，美國(guó)alltech公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;多功能高速粉碎機(jī)，上海廣沙工貿(mào)有限公司;超凈工作臺(tái)，蘇州空氣凈化設(shè)備廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌株活化培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0;種子培養(yǎng)基(g/L):骨粉 15.0，NaCl 5.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):骨粉200.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬骨泥加工工藝

酶解:蛋白酶protexTMP在65℃，pH9.0，加酶量為6 000 U/g條件下酶解7 h后，于100℃水浴中加熱3～5 min，酶解液離心后取上清液備用。

發(fā)酵:Bacillus subtilis F2和L.plantarum M1種子液按菌株比1.3∶1，以3%接種量接種，37℃，150 r/min的條件下分別發(fā)酵36 h。發(fā)酵液離心后取上清液備用。

酶解-發(fā)酵:豬骨泥進(jìn)行酶解后，以Bacillus subtilis F2和L.plantarum M1種子液按菌株比2∶1，接種量3%接種，37℃，150 r/min的條件下分別發(fā)酵30 h。發(fā)酵液離心后取上清液備用。

1.2.2 總氮的測(cè)定

采用凱氏定氮法［4］。

1.2.3 小肽含量的測(cè)定

采用 TCA 沉淀法［5］。

1.2.4 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法［6］。

1.2.5 氨基酸的測(cè)定［7］

1.2.6 羥脯氨酸的測(cè)定［8］

1.2.7 發(fā)酵液抗氧化性測(cè)定

(1)清除DPPH自由基能力的測(cè)定

取1.5 mL發(fā)酵上清液加入1.5 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)i，空白組以等體積95%乙醇代替DPPH溶液，記作Aj;對(duì)照組以等體積去離子水代替樣品記作Ao。DPPH自由基清除率:

DPPH(%)=［1-(Ai-Aj)/Ao］。

(2)清除羥自由基(·OH)［9］能力、清除超氧自由基(O2-·)［10］能力測(cè)定及還原力測(cè)定［11］

1.2.8 酶解產(chǎn)物多肽分子量分布

采用高效液相色譜法。色譜條件:色譜柱:TSK-gel2000 SWXL(300 mm×7.8 mm);流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流速:0.5 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)測(cè)定均重復(fù)3次，所獲結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。采用Duncan新復(fù)極差法分析95%的置信區(qū)間內(nèi)不同處理間顯著性差異，所用軟件為 SPSS 19.0(SPSS Inc，Chicago，Illinois，USA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解-發(fā)酵處理豬骨泥可溶性膠原蛋白及可溶性鈣含量分析

膠原蛋白是一類(lèi)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的功能性蛋白，而羥脯氨酸是其主要成分之一，在正常膠原蛋白中占13.4%［12］。由于豬骨中富含膠原蛋白，水解后骨泥中的羥脯氨酸(Hyp)含量在一定程度上可以反映其可溶性膠原蛋白的含量。不同處理后豬骨泥羥脯氨酸及可吸收性鈣含量如圖1所示。

圖1 不同處理下樣品中Hyp及可溶性鈣含量Fig.1 The contents of soluble hydroxyproline and soluable calciumin different samples

由圖1可知，與酶解樣品相比，酶解-發(fā)酵處理樣品中Hyp及可吸收性鈣含量分別提高了68.16%和112.79%;與菌株發(fā)酵處理樣品相比分別提高了95.38%和44.09%。表明酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)對(duì)產(chǎn)品中可溶性膠原蛋白及可吸收性鈣含量有著顯著性影響(P＜0.05)。利用安全菌株乳酸菌分泌有機(jī)酸溶出骨泥中以羥基磷灰石結(jié)構(gòu)存在的鈣，變成利于人體消化吸收的可吸收性鈣，同時(shí)骨泥結(jié)構(gòu)疏松多孔，表面積增加，使得未被蛋白酶酶解的骨蛋白在發(fā)酵菌株作用下分解為可溶性膠原蛋白及小肽、氨基酸。

2.2 酶解-發(fā)酵處理豬骨泥氨基酸含量分析

利用高效液相色譜對(duì)不同處理樣品中的氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果如表1。由表1可知，與酶解處理樣品相比，酶解-發(fā)酵處理樣品中必需氨基酸、抗氧化性氨基酸、鮮味氨基酸含量分別提高了65.84%、141.9%和112.25%;與菌株發(fā)酵處理樣品相比分別提高了37.44%、109.21%和48.18%?？梢?jiàn)，酶解-發(fā)酵處理提高了樣品中的必需氨基酸、鮮味氨基酸、抗氧化性氨基酸含量，在豐富產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)又提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)保健功能特性。

表1 不同處理樣品的氨基酸含量Table 1 Amino acids composition of different hydrolysates

2.3 酶解-發(fā)酵處理豬骨泥小肽含量及蛋白水解物分子量分布

豬骨蛋白水解產(chǎn)物中多肽的分子質(zhì)量大小及分布是決定其功能性重要因素之一，不僅反映蛋白的水解程度，而且與水解物的抗氧化特性有著密切聯(lián)系［13］。

由圖2可見(jiàn)，3種加工工藝在其最佳處理?xiàng)l件下，酶解-發(fā)酵處理樣品水解度(DH)、小肽含量均高于另兩種處理，分別為61.26%、19.16 mg/mL。由表2可知，豬骨蛋白經(jīng)酶解-發(fā)酵處理后，酶解-發(fā)酵技術(shù)對(duì)分子質(zhì)量大于5 kDa多肽含量無(wú)顯著性影響(P＞0.05)，但對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 Da的小肽所占的比例有顯著提高(P＜0.05)，占54.38%。生物活性肽常含有2～20個(gè)氨基酸且分子質(zhì)量越小能夠被腸道吸收呈現(xiàn)生物活性功能的可能性越大［14］。由此可見(jiàn)，酶解-發(fā)酵處理技術(shù)提升了產(chǎn)物的功能特性。

圖2 不同處理下樣品骨蛋白水解度和小肽含量Fig.2 The DH and the content of peptides in different samples

表2 骨蛋白水解后分子質(zhì)量分布及其所占比例Table 2 The molecular mass distribution and proportion of peptides of different samples

注:表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。小寫(xiě)字母表示P≤0.05，不同字母表示差異顯著(Duncan新復(fù)極差法分析)。

2.4 酶解-發(fā)酵處理豬骨泥抗氧化活性分析

清除DPPH自由基、超氧陰離子(O2-·)、羥基自由基(·OH)的能力和對(duì)鐵的還原能力是衡量物質(zhì)抗氧化活性的常用關(guān)鍵指標(biāo)。對(duì)不同發(fā)酵樣品進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，酶解-發(fā)酵處理對(duì)豬骨泥抗氧化活性有著顯著性影響(P＜0.05)。與酶解樣品相比，酶解-發(fā)酵處理樣品的清除O2-·的能力、清除·OH的能力和對(duì)鐵的還原能力分別提高了約45.32%、73.23%、164.23%，發(fā)酵處理樣品的抗氧化活性略高于酶解處理樣品。酶解-發(fā)酵處理后的豬骨泥小分子短肽比例大大提高，含有更多可以作為電子供體的底物，能夠與自由基結(jié)合轉(zhuǎn)化為狀態(tài)比較穩(wěn)定的物質(zhì)終止自由活性鏈反應(yīng)［15］，使得其抗氧化活性得以提高。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間樣品的抗氧化活性的分析Fig.3 Analysis of antioxidant capacity in different samples

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，與商品酶酶解樣品相比，酶解-發(fā)酵技術(shù)處理樣品對(duì)可溶性膠原蛋白、可吸收性鈣、小肽含量有顯著提高，可溶性膠原蛋白中羥脯氨酸及可吸收性鈣含量分別提高了95.38%和112.79以上;必需氨基酸含量提高了2倍以上，鮮味氨基酸、抗氧化氨基酸分別提高了112%和142%。酶解-發(fā)酵處理樣品產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于1 000 Da的小肽所占的比例為54.38%，提高了78.73%，抗氧化活性提高了45.32% ～164.23%。結(jié)果表明，酶解-發(fā)酵技術(shù)不僅提高了豬骨泥原料的利用率，還增強(qiáng)了其營(yíng)養(yǎng)保健功能，為開(kāi)發(fā)高品質(zhì)且具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的豬骨基原料品提供了依據(jù)。

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