牛血與肌原纖維蛋白混合物的凝膠特性*

高雷，盧士玲，張冬冬，田盼

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

我國畜血資源豐富，然而，在我國絕大多數(shù)屠宰廠，牲畜屠宰后的血液，除極少量用于制作血豆腐或飼料外，大部分畜血被廢棄，不僅蛋白質(zhì)資源流失，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［1］。畜血的蛋白質(zhì)含量很高，和肉相近，被稱為“液體肉”，有很大的利用價(jià)值。若能將畜血應(yīng)用到肉與肉制品加工中，則可以充分利用其營養(yǎng)價(jià)值。

肌原纖維蛋白是肌肉中一類具有重要生物學(xué)功能特性的鹽溶結(jié)構(gòu)蛋白群，主要由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白等構(gòu)成［2］。肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠對肉制品的硬度、保水性、質(zhì)地等特性有重要的影響，而這些功能特性是量化產(chǎn)品的質(zhì)量和開發(fā)新的肉制品的關(guān)鍵因素，因此研究肌原纖維蛋白凝膠特性對肉制品加工很重要［3-4］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究了pH、溫度、離子強(qiáng)度和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶等因素對肌原纖維蛋白功能特性的影響［5-7］。本實(shí)驗(yàn)將不同量的牛血添加到肌原纖維蛋白中，通過測定牛血-肌原纖維蛋白混合物的乳化能力、凝膠保水性和凝膠強(qiáng)度的變化情況，來研究血液添加量對牛血-肌原纖維蛋白混合物凝膠特性和乳化能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬里脊肉，石河子好家鄉(xiāng)超市;牛血，石河子西部牧業(yè)屠宰場;EGTA、牛血清蛋白(BSA)Sigma試劑公司，分析純;其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Neofuge臺式高速冷凍離心機(jī)(15R)，方康發(fā)展有限公司;T25-DS25勻漿機(jī)，UCTRA-TURRAX;Uvmini-1240紫外可見分光光度計(jì)，SHIMADZU CORPORATIDN;H18424NEW pH計(jì)，北京哈納科技有限公司;CT3質(zhì)構(gòu)儀，北京東林昌盛生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取

參照韓敏義等［8］的方法提取肌原纖維蛋白，100 g解凍的肌肉打碎勻漿后，加入4倍體積的僵直提取緩沖液(100 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH 8.3)，1 000×g離心20 min收集沉淀。把沉淀分散在4倍體積的標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(SSS)(100 mmol/L KCl，20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L NaN3，pH 7.0)，1 000×g離心10 min收集沉淀，重復(fù)3次，在2次離心之間用高速分散器分散約30 s。沉淀重新分散在4倍體積含1%Triton X-100的SSS中，而后1 500×g離心10 min收集沉淀，重復(fù)2次，沉淀加入4倍體積0.1 mol/L KCl，重復(fù)2次。最后沉淀加入4倍體積0.l mol/L NaCl，1 500×g離心10 min收集沉淀，得到純化的肌原纖維蛋白。將肌原纖維蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4)中，蛋白質(zhì)濃度用雙縮脲法測定［9］，用牛血清白蛋白做蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取的肌原纖維蛋白在24 h內(nèi)用完。

1.2.2 牛血的采集

從牛羊屠宰場采集牛血，用1%檸檬酸鈉為抗凝劑，牛血存放在4℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 肌原纖維蛋白凝膠的制備

將肌原纖維蛋白溶液調(diào)整到一定濃度，并將牛血和肌原纖維蛋白溶液以 0∶10(對照組)、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5的體積比混合，最終控制混合物中肌原纖維蛋白的濃度分別為 10、20、30、40、50、60 mg/mL。研究不同肌原纖維蛋白濃度下，牛血添加量對混合物凝膠特性的影響。凝膠制備步驟:將10 mL的混合溶液裝于離心管中，置于水浴鍋中以大約1℃/min的速率從20～70℃線性升溫，而后在70℃保溫20 min形成凝膠，于4℃冰箱內(nèi)冷卻過夜，然后進(jìn)行凝膠強(qiáng)度和保水性的測定。

1.2.4 乳化能力的測定

取一定濃度的肌原纖維蛋白溶液，添加不同量(體積比0∶10～5∶5)的血液，得到的混合溶液測定乳化能力。以乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)表示肌原纖維蛋白的乳化能力，采用濁度法測定［10］。將混合蛋白溶液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋，使混合物蛋白濃度為1 mg/mL(已用凱氏定氮法測定牛血含量為21%)。測定時(shí)，分別取2.0 mL大豆油和8.0 mL混合蛋白溶液置于體積為50 mL的塑料離心管中，高速勻漿1 min，立即從距離心管管底0.5 cm的地方用微量取樣器取出50 μL勻漿液，加入到含有5 mL 0.1%的SDS溶液的試管中，振蕩均勻后用紫外分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光值記作A0，勻漿后10 min再次在相同位置取勻漿液50 μL，加入到另一個(gè)含有5 mL 0.1%的SDS溶液的試管中，振蕩混勻后測定吸光值記做A10，同時(shí)用0.1%的SDS溶液作空白對照。根據(jù)公式計(jì)算EAI和ESI:

式中:c為蛋白質(zhì)濃度;φ為乳化液中油所占的體積比;n為乳狀液稀釋的倍數(shù);A0、A10為乳狀液在0 min和10 min的吸光值。

1.2.5 凝膠強(qiáng)度的測定

利用CT3質(zhì)構(gòu)儀測定樣品的凝膠強(qiáng)度［11］，計(jì)算公式為:

凝膠強(qiáng)度/(g·mm)=斷裂強(qiáng)度(g)×凹陷深度(mm)。

1.2.6 凝膠保水性的測定

凝膠保水性的測定基于Kocher和Foegeding的離心法［12］。將制備的混合物凝膠于0～4℃下經(jīng)10 000×g離心10 min去除離出的液體，記錄空離心管的重量以及離心前后離心管與凝膠的總重。根據(jù)公式計(jì)算凝膠保水性(WHC):

式中:m為離心管重，質(zhì)量為離心前離心管與凝膠質(zhì)量;m2為離心后離心管與凝膠質(zhì)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19進(jìn)行方差分析，如果方差分析效應(yīng)顯著，使用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 血液添加量對牛血-肌原纖維蛋白混合物凝膠強(qiáng)度的影響

不同肌原纖維蛋白濃度下血液添加量對混合物凝膠強(qiáng)度的影響(如圖1)，添加血液后，混合物的凝膠強(qiáng)度比肌原纖維蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度明顯增加。隨著血液添加比例的不斷增加，混合物的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)增加的趨勢。通過比較發(fā)現(xiàn)，添加體積比為1∶9時(shí)與對照組相比，混合物的凝膠強(qiáng)度增加不顯著(P＞0.05);當(dāng)添加比例在2∶8～4∶6時(shí)，混合物的凝膠強(qiáng)度隨著血液添加比例的增加而顯著增加(P＜0.05)。繼續(xù)添加血液后，比例5∶5與比例4∶6相比，混合物的凝膠強(qiáng)度差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 不同肌原纖維蛋白濃度下血液添加量對混合物凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of blood on gel strength of the mixture at different concentration of myofibrillar protein

當(dāng)比例一定時(shí)，凝膠的凝膠強(qiáng)度隨著蛋白濃度的增加呈現(xiàn)增加的趨勢。通過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為10和20 mg/mL時(shí)，兩者凝膠的凝膠強(qiáng)度大小差異不顯著(P＞0.05)，當(dāng)濃度為20～60 mg/mL時(shí)，隨著濃度的增加，隨著濃度的增加凝膠的凝膠強(qiáng)度大小增加差異顯著 (P＜0.05)。因血液本身具有凝膠性，加入到肌原纖維蛋白后，兩者共同交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使肌原纖維蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度有了較大的提高?？梢钥闯?，在體積比0∶10～4∶6時(shí)，隨著血液添加量的增加，血液-肌原纖維蛋白混合物的凝膠強(qiáng)度明顯增加;但體積比在4∶6之后繼續(xù)添加血液，混合物的凝膠強(qiáng)度變化不顯著。

2.2 血液添加量對牛血-肌原纖維蛋白混合物凝膠保水性的影響

不同肌原纖維濃度下血液添加量對混合物凝膠強(qiáng)度的影響(如圖2)，隨著血液添加量不斷增加，混合物凝膠的保水性基本呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢。加入血液后，凝膠的保水性減小且差異不顯著(P＞0.05)。體積比0∶10～2∶8，凝膠的保水性逐漸減小且在比例為2∶8時(shí)，凝膠保水性達(dá)到最低;從比例2∶8到4∶6，凝膠的保水性逐漸增大，并且凝膠的保水性增加顯著(P＜0.05)。比例為5∶5與4∶6，相比較差異不顯著(P＞0.05)。因此，當(dāng)添加血液比例在0∶10～3∶7時(shí)，與對照組相比凝膠的保水性減小;當(dāng)添加比例達(dá)到4∶6以上時(shí)，與對照組相比，混合物凝膠的保水性增大。因此選擇4∶6以上的比例進(jìn)行添加血液，可提高凝膠的保水性。當(dāng)添加少量血液時(shí)，凝膠的保水性下降，可能是因?yàn)樯倭康难嚎梢宰璧K肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，使凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)截留水分減少，從而使凝膠保水性降低，當(dāng)添加量加大時(shí)，血液凝膠保水性的逐漸顯現(xiàn)，占據(jù)主要地位，從而混合凝膠的保水性增大。還可從圖2中看出，隨著肌原纖維蛋白濃度的增加，凝膠的保水性不斷增加。Xiong［13］和徐幸蓮等［14］都曾提出，增大蛋白質(zhì)的溶解度，能夠提高凝膠的保水性。

圖2 不同肌原纖維濃度下血液添加量對混合物保水性的影響Fig.2 Effect of blood on water-holding capacity of the mixture gel at different concentration of myofibrillar protein

2.3 血液添加量對牛血-肌原纖維蛋白混合物乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

乳化能力是指蛋白質(zhì)乳化脂肪的能力，通常以EAI和ESI反映乳化能力的大小。血液添加量對牛血-肌原纖維蛋白混合液 EAI和 ESI的影響(如圖3)，隨著血液添加量的增加，混合物的EAI呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。在體積比為4∶6時(shí)，混合物的EAI達(dá)到最大。添加血液后，混合物的EAI與對照組相比顯著增加(P＜0.05)。但在比例1∶9～5∶5，肌原纖維蛋白EAI變化差異不顯著(P＞0.05)。根據(jù)Agyare等［10］:乳化活力指數(shù)(EAI)是表示蛋白質(zhì)作為乳化劑乳化效力的一種方法。在高蛋白濃度時(shí)，蛋白在油水界面的吸收是被限制擴(kuò)散的。在低濃度時(shí)，由于肽的快速吸收，使得有較大的擴(kuò)散系數(shù)，促進(jìn)了油與樣品溶液的相互作用，而樣品濃度的增加會導(dǎo)致樣品溶液中肽的聚集，進(jìn)而使乳化活力下降。因血液中含有蛋白，少量添加后可提高EAI，但添加量過多時(shí)，體系中蛋白濃度增大，因而EAI又減小。

圖3 血液添加量對牛血-肌原纖維蛋白混合液EAI和ESI的影響Fig.3 Effect of blood on EAI and ESI ofthe mixture

牛血-肌原纖維蛋白混合物的ESI隨著添加比例的增加先增加后減少，在體積比2∶8時(shí)，混合物的ESI最大。但在體積比3∶7之后繼續(xù)添加，混合物的ESI變化差異不顯著(P＞0.05)。與對照組相比，血液-肌原纖維蛋白混合物的ESI明顯提高。

3 結(jié)論

將牛血添加到肌原纖維蛋白后，混合物的乳化能力和凝膠強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。與對照組相比，添加血液后混合物的凝膠強(qiáng)度顯著提高(P＜0.05)，且隨著比例的增加凝膠強(qiáng)度不斷增大，但比例4∶6之后繼續(xù)添加變化不顯著(P＞0.05);混合物的凝膠保水性先降低后增加，當(dāng)添加比例達(dá)到4∶6以上時(shí)，與對照組相比凝膠的保水性明顯增大;添加血液后混合物溶液的EAI和ESI顯著增加(P＜0.05)且在體積比為4∶6時(shí)混合物的EAI最大。由此看出，當(dāng)添加牛血比例為4∶6時(shí)，牛血-肌原纖維蛋白混合物具有較好的凝膠強(qiáng)度、保水性和乳化活性指數(shù)。

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