黑曲霉木聚糖酶的同源表達及其高產木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化*

倪大偉，李瑞云，白愛枝，張文濤，王軍

1(內蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室，內蒙古呼和浩特，010021)

2(內蒙古大學生命科學學院，內蒙古呼和浩特，010021)3(內蒙古大學 物理科學與技術學院，內蒙古呼和浩特，010021)

黑曲霉(Aspergillus niger)具有多種活性較強的酶系，是重要的酶制劑生產菌種，也是木聚糖酶的生產菌種之一。隨著真菌基因組學和基因微陣列及蛋白質組學等實驗技術的發(fā)展，利用絲狀真菌作為宿主表達同源和異源蛋白也得到快速發(fā)展和應用［1］，黑曲霉作為絲狀真菌的代表性菌種之一，其表達系統(tǒng)也越來越受到科技工作者的關注［2-3］。黑曲霉是國際公認的安全生產菌株［4］，并且其本身具有強大的蛋白質胞外分泌能力，有完善的翻譯后加工功能及成熟的發(fā)酵工藝等優(yōu)點，是外源和內源蛋白表達的優(yōu)良宿主。

木聚糖酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，在食品、飲料、造紙和飼料等方面有廣泛的應用。目前市場上大部分高效木聚糖酶產品的技術核心都屬于國外公司，因此通過基因工程技術，構建高表達的木聚糖酶工程菌，對于降低木聚糖酶的價格促進其應用水平，是國內木聚糖酶工業(yè)所面臨的最緊迫的問題。黑曲霉產木聚糖酶基因xynB的同源表達研究的甚少，2005年Anthony等［5］利用 RT-PCR 從 A.niger BRFM281 mRNA擴增的帶有6個his標簽的xynB基因克隆到有gpd強啟動子的表達盒，將該表達盒在蛋白酶陰性突變株Aspergillus niger D15#26中進行表達，獲得的1株基因工程菌的木聚糖酶產量達到900 mg/L，酶活力為625 U/mL;國內的鄭瑞娟［6］從A.niger TS1中利用同樣方法克隆得到xynB基因，通過構建與葡萄糖淀粉酶的融合表達質粒，在尿嘧啶缺陷型A.niger M54中表達，獲得的重組菌的酶活力最高達507 IU/mL，分別是原出發(fā)菌和宿主菌的6.7倍和3.89倍。Record等［7］利用 Aspergillus nidulans gpd基因的啟動子、5’非編碼區(qū)和終止子將A.niger來源的阿魏酸脂酶faeA基因進行同源表達，表達量較原始菌株提高24.5 倍，達 1 g/L;Anthony Levasseur［8］采用同樣的策略表達A.niger BRFM131的阿魏酸脂酶faeB基因，產量較原菌株提高了16倍;同源表達較之異源表達，可有效避免異源表達中難以解決的問題，如分泌過程中蛋白的錯誤折疊和被內源蛋白酶降解的可能以及物種密碼子的偏好性、基因結構的復雜性等，多種蛋白酶同源表達的成功，表明該策略具有廣泛的應用價值。本實驗室從A.niger A327中克隆了木聚糖酶基因xynB［9］，采用同源表達策略將其表達在黑曲霉菌株A.niger A327中，本文對木聚糖酶活力最高的轉化子A.niger A70菌株的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

出發(fā)菌株黑曲霉A.niger A327，由內蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室保藏;質粒 VHb和p3SR2由中國科學院微生物所唐國敏教授惠贈。

1.2 主要儀器與試劑

TU-1800PC紫外-可見分光光度計，北京譜析通用儀器設備有限責任公司;DYY-12型電泳儀，北京六一;ZHWY-1102/1121型普通搖床，上海智誠，主要試劑:木聚糖(birchwood xylan)，美國sigma公司;玉米芯麩皮購于呼和浩特市郊，玉米芯經粉碎機粉碎后備用;其他化學試劑均為國產分析純。

1.3 表達載體的構建及其表達

從A.niger A327中克隆編碼xynB結構基因及其5’調控區(qū)序列片段，總長1611bp，將其與目的載體pBS-T 連接［5］，并轉化 E.coli DH5α，挑取單克隆，鑒定陽性克隆子，分別將從質粒VHb和質粒p3SR2酶切得到的來源于A.nidulans的終止子TtrpC和選擇標記基因amdS連接到已連入xynB基因的T載體中，得到表達載體pBS-XTP(圖12，并利用原生質體轉化技術將表達載體轉入菌株A327中，通過搖瓶發(fā)酵篩選產木聚糖酶活力最高的轉化子。

圖1Fig.1

1.4 木聚糖酶活力的測定方法［10］

取適當稀釋的粗酶液0.1 mL，加到1 mL、1%的樺木木聚糖懸浮液中(pH5.0，0.2 mol/L醋酸緩沖液配制)于50℃水浴反應10 min，用 DNS(3，5-二硝基水楊酸)法，測定產生的還原糖。以木糖為標準，在本實驗條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位U/mL。

1.5 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

分離培養(yǎng)基(g/L):麩皮5，蛋白胨1，瓊脂20，Manders營養(yǎng)鹽液［11］定容 1 000 mL，pH 自然。PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200(去皮、切塊煮30 min，紗布過濾)，葡萄糖20，瓊脂15，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然。基礎產酶培養(yǎng)基(g/L):玉米芯75，麩皮24，Manders營養(yǎng)鹽液 1 000 mL，pH5.5 ～6.0。以上培養(yǎng)基在沒有添加糖蜜的情況下均在121℃滅菌30 min，添加糖蜜的培養(yǎng)基在115℃滅菌30 min;固體培養(yǎng)，置于30℃下培養(yǎng)4～5 d;液體培養(yǎng)，30℃下，搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵4 d，搖床轉速為200 r/min。

1.6 基因工程菌產木聚糖酶條件優(yōu)化

1.6.1 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，保持其他條件不變，分別添加不同濃度的玉米芯(40，50，60，70，80，90 g/L)，不同濃度的麩皮(15，20，25，30 g/L)，不同濃度的糖蜜(0，2，4，6，8，10 g/L)以及濃度均為 6 g/L的不同氮源((NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、尿素)，進行搖瓶發(fā)酵，研究各因子對木聚糖酶酶活的影響。

1.6.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

在基礎產酶培養(yǎng)基的條件下，分別設置不同溫度(25℃(室溫)、28℃(黑曲霉A327產酶最適生長溫度)、31 ℃、34 ℃)，接種量(1.0、1.5、2.0、2.5 mL，孢子懸液濃度 108個/mL)，裝液量(30、45、60 mL)和搖床轉速(180、200、220轉/min)對基因工程菌A70的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1.6.3 培養(yǎng)基的正交試驗

設計了4因素3水平的L9(34)正交試驗(見表1)，進一步對營養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

表1 正交設計方案 單位:g/LTable1 Orthogonal design project

1.6.4 最適發(fā)酵條件驗證

利用上述單因素和正交試驗獲得的最適發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成進行最適發(fā)酵條件的驗證實驗。

以上發(fā)酵試驗均設置3組平行試驗，取平均水平，以發(fā)酵96 h上清液的木聚糖酶活力作為考核指標考察各因素對基因工程菌A70產木聚糖酶的影響。

2 結果與分析

2.1 xynB基因在A.niger A327中的同源表達

將出發(fā)菌株A327菌株和篩選的部分轉化子(包括產酶水平最高的A70轉化子)分別在100 mL搖瓶中，28℃，200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵上清液離心得到粗酶提取液，沸水煮沸5 min，取相同體積的粗酶液進行SDS-PAGE(結果見圖2)?？梢娋闍37，A55，A70，A74，A75，A77，A78 均不同程度地表達了xynB基因，木聚糖酶的產量不同程度的有所提高。目的產物分子量約為21 kDa，從圖中可以看出A63菌株產木聚糖酶的量較對照還要低，而A70菌株分泌木聚糖酶的量最多，這與發(fā)酵后酶活測定的結果一致(見表2)。表達程度的高低與xynB基因插入的拷貝數有關，在一定范圍內插入拷貝數越多，表達量越高，當拷貝數進一步提高，或許由于調控蛋白的滴定效應，表達不再上升［12］，這一基因劑量效應在外源蛋白的表達中同樣成立。從圖中可以看出有的菌株在表達xynB基因的同時，使其他蛋白的分泌有所提高，這可能與xynB基因所插入的位置有關，正好使其他蛋白的表達受到調控，提高了產量。

圖2 轉化株產酶的SDS-PAGE分析Fig.2 The SDS-PAGE detection of xylanase transformants

表2 轉化株發(fā)酵的木聚糖酶活力(IU/mL)Table 2 Xylanase activity of transformants fermentation

2.2 高效表達菌株A70的遺傳穩(wěn)定性

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現在重組質粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現形式:其一是結構不穩(wěn)定性，重組 DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失;其二是分配不穩(wěn)定性，整個重組 DNA分子從受體細胞中逃逸。將A70菌株進行斜面到斜面的傳代培養(yǎng)，傳代6次后，在基礎產酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，將經不同傳代次數的A70菌株同時進行發(fā)酵實驗，結果(見表3)顯示，該菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

表3 Strain A70菌株的傳代酶活測定Table 3 The enzyme activity from continual inoculation of A70

2.3 發(fā)酵時間對菌株A70產酶的影響

隨著發(fā)酵時間的延長，微生物的代謝產物隨之增加，但分泌的代謝產物量通常受到營養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件等多種因素的影響。實驗采取在相同的培養(yǎng)條件下，利用基礎產酶培養(yǎng)基對出發(fā)菌株A327和基因工程菌A70的發(fā)酵特性進行比較。結果如圖3和圖4所示，可見發(fā)酵96 h基因工程菌A70達到產酶高峰期，較出發(fā)菌株A327的產酶周期延長24 h，這可能是由于其基因序列中插入了表達載體，使得菌體的生長變慢或者使菌體的代謝調控機制受到影響，而使產酶周期延長，工程菌A70產酶水平為360 IU/mL，較出發(fā)菌株A327提高約16倍。

圖3 黑曲霉菌株A327的產酶曲線Fig.3 The cure of Strain A327 on xylanase production

圖4 黑曲霉菌株A70的產酶曲線Fig.4 The curve of A70 on xylanase production

2.4 高表達菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

在基礎產酶培養(yǎng)基條件下，根據實驗的目的添加或改變相應的條件，對產酶水平最高的基因工程菌A70的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

2.4.1 碳源濃度對產酶的影響

在前期的研究中發(fā)現出發(fā)菌株A327以玉米芯為碳源時產木聚糖酶活力最高［13］，因此以玉米芯為主要碳源考察其初始發(fā)酵濃度對基因工程菌株A70產木聚糖酶的影響，結果見圖5，90 g/L的起始玉米芯濃度產酶的活力最高，同時也發(fā)現該濃度下發(fā)酵液因失水較多而變得粘稠，其次是80，40 g/L稍次之。

圖5 玉米芯的量對產酶的影響Fig.5 Effect of corncob concentration on xylanase production

2.4.2 麩皮質量濃度對產酶的影響

本試驗在2.3.1的基礎上，在其它條件不變的情況下，分別以玉米芯質量濃度為40、80和90 g/L，添加不同比例的麩皮進行發(fā)酵研究，發(fā)現當玉米芯濃度和麩皮濃度為80 g/L和15 g/L時菌株A70產木聚糖酶的活力最高(結果見表4)。

表4 麩皮質量濃度對產木聚糖酶活力的影響 單位:IU/mLTable 4 Effect of bran concentration on xylanase production

2.4.3 附加碳源濃度對產酶的影響

通常微生物發(fā)酵所需的碳源不止一種，而且不同種類的碳源對微生物代謝產物的分泌都有較大的影響。在其它條件不變的情況下，以玉米芯濃度為80 g/L，麩皮濃度為15 g/L，添加不同的速效碳源淀粉、葡萄糖、蔗糖、甜菜糖蜜、麥芽糖，發(fā)現菌株對甜菜糖蜜的利用效果最好。糖蜜是制糖工業(yè)的副產品，其組成因制糖原料、加工條件的不同而有差異，因其含有大量的蔗糖，因此是很好的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基組分。對菌株A70來說，其利用甜菜糖蜜發(fā)酵產酶效果較單純的蔗糖好的原因可能是糖蜜中還含有較多的礦物質成分以及其他營養(yǎng)素，對菌株的生長更有利。通過添加不同濃度的糖蜜考察其對菌株A70產木聚糖酶的影響，發(fā)現當添加的糖蜜濃度為12 g/L時，菌株產木聚糖酶的活力最高(見圖6)。

圖6 糖蜜質量濃度對產酶的影響Fig.6 Effect of molasses concentration on xylanase production

2.4.4 不同氮源對產酶的影響

在上述實驗結果的基礎上，培養(yǎng)基以80 g/L玉米芯，15 g/L麩皮，Mandels鹽液中去除(NH4)2SO4和 NaNO3后，分別加入(NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、尿素，質量濃度為6 g/L，對照為原Mandlels鹽液不變，來研究氮源對產木聚糖酶的影響，結果見圖7，可見菌株A70對氮源的利用以尿素的產酶效果最好，NaNO3次之;但是實驗發(fā)現以尿素為氮源時，到發(fā)酵終點培養(yǎng)基的失水較嚴重，相比之下NaNO3的發(fā)酵效果更好。

圖7 不同氮源對產酶的影響Fig.7 Effect of different nitriogen source on xylanase production

2.5 發(fā)酵條件對產酶的影響

以基礎產酶培養(yǎng)基對菌株A70的發(fā)酵溫度、接種量及溶氧條件進行了研究，試驗表明，產酶的最適溫度為28～30℃(見表5)，最適接種量為1.5 mL/瓶(見表6)，最適裝液量為30 mL/瓶，當搖床轉速逐漸從180 r/min增加到220 r/min時，菌株的產酶水平隨之提高，說明菌株對溶氧的需求較高(見表7)，這也符合霉菌生長的特點。

表5 不同發(fā)酵溫度對酶活的影響Table 5 The effect of different fermentation temperature

表6 接種量對菌株發(fā)酵產酶的影響Table 6 The effect of inoculation quantity on xylanase production

表7 溶氧對發(fā)酵的影響Table 7 The effects of ventilation in fermentation

2.6 發(fā)酵產酶培養(yǎng)基的正交試驗

上述實驗僅考慮了各個因素單獨的作用，未考慮各個因素均發(fā)生變化時，高產菌株發(fā)酵水平的變化。為了獲得同源表達基因工程菌黑曲霉A70最佳的產酶營養(yǎng)條件，選用L9(34)表設計了4因素3水平的正交試驗(見表1)進一步對營養(yǎng)條件進行優(yōu)化。正交試驗結果見表8。

表8 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test design

通過直觀分析正交試驗的結果，可以看出影響基因工程菌A70產酶的各因素主次順序為A＞C＞D＞B，最優(yōu)組合為玉米芯80 g/L，麩皮18 g/L，糖蜜14 g/L，NaNO38 g/L，在該組合下菌株產酶的最高水平為12586 U/mL。

2.7 最佳工藝條件驗證

按2.5確定的最佳培養(yǎng)基配方和2.4確定的最適發(fā)酵條件進行3次平行實驗，平均產酶水平為12 639 U/mL(見表9)，實驗結果表明，發(fā)酵工藝的重現性好，菌株的產酶水平穩(wěn)定。

表9 最適發(fā)酵條件驗證Table 9 The validation of optimal fermentation conditions

3 結論

通過對黑曲霉同源表達高產菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌株的發(fā)酵周期為4天，發(fā)酵培養(yǎng)基以玉米芯80 g/L，麩皮18 g/L，糖蜜14 g/L，NaNO38g/L，30 mL無氮Mandels營養(yǎng)液為最適培養(yǎng)基配方。發(fā)酵溫度為28～30℃，接種量為1.5 mL/瓶，搖床轉速以220 r/min發(fā)酵產酶水平最高，在上述優(yōu)化的條件下基因工程菌A70產酶水平為12 664 U/mL，較優(yōu)化前的3 601 U/mL提高約3.5倍。同源表達木聚糖酶的黑曲霉菌株A70發(fā)酵產酶水平較高，生產成本低，該實驗為用黑曲霉表達系統(tǒng)高效表達其他酶類提供了參考。

［1］ Owen P.Ward.Production of recombinant proteins by filamentous fungi［J］.Biotechnology Advances，2012，1119-1139.

［2］ Roth AH.Dersch.P.A novel expression system for intracellular production and purification of recombinant affinitytagged proteins in Aspergillus niger［J］.Appl Microbiol Biotechnol(2010)86:659-670

［3］ Amaro-Reyes A，Garci'a-Almenda'rez BE，Va'zquez-Mandujano DG，et al.Homologue expression of a b-xylosidase from native Aspergillus niger［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2011(38):1311-1319.

［4］ Punt PJ，VAN Biezen N，Conesa A，et al.Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production.Trends in Biotechnology，2001，20:200-6.

［5］ Levasseur A，Asther M，Record E.Overproduction and characterization of xylanase B from Aspergillus niger.Can J Microbiol，2005，51:177-183

［6］ 鄭瑞娟.黑曲霉木聚糖酶在同源宿主中的分泌性表達及酶學特性研究［D］.上海:同濟大學碩士學位論文，2006.

［7］ Record E，Asther M，Sigoillot C，et al.Overproduction of the Aspergillus niger feruloyl esterase for pulp Bleaching application.Appl Microbiol Bioteehnol.20O3(62):349-355

［8］ Levasseur A，Benoit I，Astger M，et al.Homologous expression of the feruloyl esterase B gene from Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme..Protein Expression and purifieation.2004(37):126-133.

［9］ 白愛枝，閆祖威，唐國敏，等.黑曲霉木聚糖酶結構基因和5'調控區(qū)基因克隆及其分析［J］.華北農學報，2009，24(5):73-76.

［10］ Bailey MJ，Biely P，Poutanen KJ.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase［J］.J Biotechnol，1992，23:257-270

［11］ Mandels M，Weber J.The production of cellulase［J］.Adv Chem Ser，1969(95):391-413

［12］ Verdoes J C，Punt P J，Stouthamer A H，et al.，The effect of multiple copies of the upstream region on expression of the Aspergillus niger glucoamylase-encoding gene［J］.Gene，1994，145(2):179-87.

［13］ 白愛枝，鮑秀珍，潘仁瑞.碳源和氮源對黑曲霉產木聚糖酶的影響［J］.飼料工業(yè)，2006，27(2):17-20.