右美托咪定對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌VEGF表達(dá)的影響

黨旭云，蔚俊星，李 靜(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安 70077;西安市第四醫(yī)院麻醉科;通訊作者，E-mail:d98403@6．com)

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種新型的高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有劑量依賴性鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮性等作用，且對(duì)呼吸循環(huán)的抑制作用輕微［1］。近年來已廣泛應(yīng)用于心血管手術(shù)麻醉，并收到了很好的效果?，F(xiàn)已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)右美托咪定預(yù)處理可減輕心肌缺血再灌注損傷［2］，但對(duì)于其心肌保護(hù)的潛在機(jī)制尚不清楚。本研究擬觀察Dex預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷(myocardium ischemia-reperfusion injury，MIRI)大鼠VEGF表達(dá)的影響，探討其對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠40只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重約220－250 g，隨機(jī)分為四組(n=10):假手術(shù)組(A):只穿線不結(jié)扎LAD;MIRI組(B):結(jié)扎LAD前30 min，腹腔注射生理鹽水5 ml/kg;MIRI+Dex10 μg/kg組(C):Dex 用生理鹽水稀釋成2 μg/ml，結(jié)扎LAD前30 min腹腔注射 Dex 10 μg/kg;MIRI+Dex 30 μg/kg 組(D):Dex用生理鹽水稀釋成2 μg/ml，結(jié)扎LAD前30 min，腹腔注射 Dex 30 μg/kg。

1．2 心肌缺血再灌注模型的建立

健康雄性SD大鼠，稱重后烏拉坦腹腔注射，麻醉后仰臥位固定于鼠板，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄心電圖。氣管切開，放入氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。胸骨左側(cè)第三、四肋間切口，剪斷肋骨，暴露胸腔，破心包膜，使心臟充分暴露，在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間找到與左前降支(LAD)伴行的靜脈，放置橡皮條緊密結(jié)扎。以心電圖QRS增高、增寬，ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志。排出胸腔氣體，關(guān)閉胸腔。于結(jié)扎成功30 min后，剪斷結(jié)扎線，拔出橡皮條，再灌注2 h。

1．3 指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠處死，取出心臟用0．9%氯化鈉液沖洗，10%甲醛固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，于心肌梗死區(qū)中部沿左室軸線每隔1 mm連續(xù)切取數(shù)個(gè)5 μm厚的切片，分別作蘇木精伊紅染色，并采用免疫組化法行VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)，具體步驟參照試劑盒進(jìn)行。

在低倍鏡下觀察并確定VEGF免疫組化陽性染色，其陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為心肌細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，然后在高倍鏡下肉眼初步比較各切片中心肌細(xì)胞所發(fā)生免疫組化反應(yīng)的強(qiáng)弱。

每組隨機(jī)選取2張陽性表達(dá)的切片，每個(gè)切片在高倍鏡下(×400)選取5個(gè)不重復(fù)的視野，以奧林巴斯(Olympus)DP71攝像顯微鏡及其配套的圖像信號(hào)采集系統(tǒng)DPcontroller拍攝圖片，使光源亮度始終保持一致，曝光時(shí)間為1/100 s，拍攝之前進(jìn)行“自動(dòng)白平衡”調(diào)節(jié)，設(shè)圖像分辨率2 040×1 536，圖像右下角放置1．0 mm標(biāo)尺，以Image-Pro Plus 6．0中文版進(jìn)行積分光密度(IOD)的測(cè)定，整個(gè)測(cè)定由一人完成，以減少偏差。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

各組大鼠心肌組織中VEGF表達(dá)的結(jié)果見表1和圖1，A組VEGF表達(dá)較多，與之相比，B組、C組表達(dá)均減少(P＜0．05);與B組相比，C組表達(dá)增加(P＜0．05)，D 組表達(dá)增加明顯(P ＜0．01);與 C 組相比，D組表達(dá)增加(P＜0．05)。

表1 各組大鼠心肌組織中VEGF的表達(dá)(n=10，±s)Table 1 The expression of VEGF in myocardium in each group(n=10，±s)

表1 各組大鼠心肌組織中VEGF的表達(dá)(n=10，±s)Table 1 The expression of VEGF in myocardium in each group(n=10，±s)

與假手術(shù)組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 MIRI組比較，#P ＜0．05，##P ＜ 0．01;與 MIRI+Dex 10 μg/kg 組比較，△P ＜0．05

分組IOD假手術(shù)組0．427 9 ±0．020 3 MIRI組 0．362 4 ±0．023 8＊＊MIRI+Dex 10 μg/kg 組 0．398 7 ±0．026 5*#MIRI+Dex 30 μg/kg 組 0．414 7 ±0．022 7##△

圖1 免疫組化法測(cè)定各組大鼠心肌VEGF蛋白的表達(dá)Figure 1 The expression of VEGF in each group by immunohistochemistry(SP，×400)

3 討論

心肌因其高氧耗和低儲(chǔ)備的特點(diǎn)，極易受到缺血缺氧性損害。及時(shí)提供缺血區(qū)心肌的血液供應(yīng)，作為解決心肌缺血的關(guān)鍵途徑，又會(huì)給心肌帶來更重的再灌注損傷。而藥物預(yù)處理通過藥物來激發(fā)或模擬機(jī)體自身釋放內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)起到心臟保護(hù)作用，同時(shí)也具有很大的臨床推動(dòng)意義。

在實(shí)驗(yàn)研究中，多選擇結(jié)扎大鼠左前降支來建立心肌缺血再灌注模型來模擬人類缺血性心臟病，且證實(shí)兩者有很高的相似性。因肉眼無法觀察到冠狀動(dòng)脈，我們根據(jù)其走形方向及與其相伴行的靜脈為標(biāo)志進(jìn)行結(jié)扎，且以心電圖上典型的ST段改變及缺血區(qū)心肌顏色變暗為結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)。采用橡皮條墊底，可用力結(jié)扎保證缺血的可靠性，同時(shí)保護(hù)冠脈不被扎斷，而且再灌注時(shí)易于操作。開胸后用小動(dòng)物呼吸機(jī)控制通氣，保證血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。

右美托咪定作為一種新型的高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，對(duì)于它的研究一直在進(jìn)行，大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，Dex預(yù)處理對(duì)心肌具有保護(hù)作用。陳盼等［3］應(yīng)用Dex預(yù)處理大鼠缺血再灌注心肌組織，發(fā)現(xiàn)Dex能夠上調(diào)Bcl-2基因和蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax基因和蛋白表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。莫曉飛等［4］證實(shí)Dex可以通過抑制心肌缺血再灌注損傷中補(bǔ)體的激活而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。Ibacache等［5］已證實(shí)，在大鼠體外或體內(nèi)心肌I/R模型上，使用Dex預(yù)處理均具有心肌保護(hù)作用，其分子水平的可能機(jī)制就是Dex與心臟α2受體結(jié)合，激活了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，然后活化下游蛋白，進(jìn)而改善了心功能。而姜翠翠等［6］研究表明Dex具有減輕離體大鼠心臟I/R損傷作用，且該心肌保護(hù)作用可能與Dex促進(jìn)缺血前mitoKATP的開放、抑制再灌注早期mPTP的開放有關(guān)。另有研究［7］則表明Dex能在一定程度上減輕體外循環(huán)下的心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

VEGF的生理功能是促進(jìn)側(cè)支血管形成，而新血管的形成有助于提高心肌灌注，增加心肌氧供，從而減輕損傷。本研究結(jié)果表明，B組心肌缺血再灌注后心肌組織中VEGF表達(dá)顯著減少(P＜0．01)，可見I/R對(duì)心肌損害嚴(yán)重。Dex預(yù)處理的C組和D組中VEGF的表達(dá)較B組均增加(P＜0．05)，表明Dex可以增加保護(hù)性因素VEGF表達(dá)，有利于提高缺血心肌血液灌注，減輕心肌損害，并且這種心肌保護(hù)作用與劑量有關(guān)。

綜上所述，右美托咪定預(yù)處理能減輕心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制與增加VEGF的表達(dá)有關(guān)，但是具體作用途徑還有待進(jìn)一步研究。

［1］Dere K，Sueullu I，Budak E，et al．A comparison of dexmedetomidine versus midazolam for sedation，pain and hemodynamic control，during colonoscopy under conscious sedation［J］．Eur J Anaesthesia，2010，27(7):648－652．

［2］Guler L，Bozkirli F，Bedirli N，et al．Comparison of the effects of dexmedetomidine vs．Ketamin in cardiac ischemial reperfusion injury in rat-preliminary stdudy［J］．Adv Clin Exp Med，2014，23(5):683－689．

［3］陳盼，趙明，蔣鵬，等．鹽酸右美托咪定預(yù)處理對(duì)缺血－再灌注損傷大鼠心肌Bax和Bcl－2表達(dá)的影響［J］．重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(16):1604－1606．

［4］莫曉飛，陳劉芳，萬晶，等．右美托咪定預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及補(bǔ)體3蛋白的影響［J］．中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2013，10(5):258－260．

［5］Ibacache M，Sanchez G，Pedrozo Z，et al．Dexmedetomidine preconditioning activates prosurvival kinases and attenuates regional ischemia/reperfusion injury in rat heart［J］．Biochim Biophys Acta，2012，1822(4):537－545．

［6］姜翠翠，夏滿莉，王敏，等．右美托咪定預(yù)處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷的線粒體相關(guān)機(jī)制［J］．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，42(3):326－330．

［7］秦志剛，艾玲，羅愛林，等．右美托咪定對(duì)體外循環(huán)下心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，42(5):551－554．