尿道致病性大腸桿菌黏附人尿路膀胱癌細胞的實驗研究

谷 超，王海濤，周曉冬，侯 敏，李 光(天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物學教研室，天津 00070;天津市泌尿外科研究所腫瘤免疫室;天津市胸科醫(yī)院檢驗科;通訊作者，E-mail:ydsweyou@6．com;共同通訊作者，E-mail:ydswlg@6．com)

尿路感染(urinary tract infections，UTIs)是人類感染性疾病的多發(fā)病。大腸桿菌是UTIs的主要致病菌，在引起下位尿路的尿道炎、膀胱炎后可上行性感染導(dǎo)致腎盂腎炎。其中引起腎盂腎炎的大腸桿菌80%以上具有P菌毛，稱為尿道致病性大腸桿菌或致腎盂腎炎大腸桿菌(Uropathogenic E．coli，UPEC)［1，2］。UPEC的pap黏附基因簇編碼的P菌毛介導(dǎo)與上皮細胞的黏附是形成感染的先決條件。同時UPEC菌株還含有編碼其他與其致病性密切相關(guān)毒力因子的基因。研究尿路感染性細菌與宿主尿路上皮細胞相互作用需要建立敏感細胞感染模型。有關(guān)UPEC對尿路細胞黏附的報道較少，本研究在前期實驗［3，4］的基礎(chǔ)上進行了UPEC菌株感染人尿路移行上皮癌細胞的相關(guān)研究，為深入探討尿路感染的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 菌株

UPEC132，源自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院的腎盂腎炎患者尿標本分離菌株，其基因型為papA F13+papGⅡ型［5］;UPECJ96 為 papA F13 型的代表株［5］;E．coli K-12p678-54為無菌毛代表株，均為Hull教授惠贈，上述菌株培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基。

1．2 UPEC毒力基因papC，hly和cnf1的PCR檢測

以受試菌株染色體DNA為模板，采用PCR方法檢測papC，復(fù)合PCR檢測hly和cnf1。用于擴增papC的上游引物5'－GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGCG－3'和下游引物5'－ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AATA－3'，擴增hly的上游引物5'－AAC AAG GAT AAG CAC TGT TCT GGCT－3'和下游引物5'－ACC ATA TAA GCG GTC ATT CCC GTCA－3'以及擴增cnf1的上游引物5'－AAG ATG GAG TTT CCT ATG CAG GAG－3'和下游引物5'－CAT TCA GAG TCC TGC CCT CAT TATT－3'，均由大連TaKaRa公司合成。反應(yīng)體系(25 μl)為:10 × buffer緩沖液2．5 μl，dNTP 0．2 mmol/L，上下游引物各 0．4 μmol/L，模板 DNA 1 μl，TaqDNA 聚合酶(TaKaRa 公司)0．25 μl。反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性5 min;95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán);最后72℃延伸7 min。試驗中以UPECJ96為陽性對照，E．coli K-12p678-54為陰性對照，同時設(shè)空白對照。

1．3 人尿路膀胱癌細胞系EJ的傳代培養(yǎng)

選取人EJ細胞系(由天津市泌尿外科研究所腫瘤免疫室提供)用于UPEC黏附尿路上皮性細胞的研究。EJ細胞的培養(yǎng)體系為含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液(Sigma公司)，添加青霉素(100 μg/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)。EJ細胞于液氮罐中凍存，用前需進行細胞復(fù)蘇，置入37℃，5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液。每日觀察細胞生長情況，隔日換液1次，傳代時加入消化液(0．25%胰蛋白酶∶0．02%EDTA 為1∶1)，隨時用倒置相差顯微鏡觀察并終止消化。傳至2－3代的細胞鋪滿瓶底80%時制備細胞爬片，將傳代細胞懸液接種于置有蓋玻片的24孔板中常規(guī)培養(yǎng)。

1．4 UPEC的細胞黏附試驗

當上述制備的單層細胞爬片細胞占玻片面積達60%時即可用于細菌黏附試驗。用吸管棄掉舊培養(yǎng)液，經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，加入未加雙抗的含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液0．9 ml。分別將UPEC132和E．coli K-12p678-54的LB平板培養(yǎng)物制備成菌懸液(107CFU/ml)，每孔加入 0．1 ml，置37 ℃，CO2孵箱內(nèi)，分別于 15，30，60，120，180 min取出，每個條件下設(shè)3個復(fù)孔。實驗中還選用受試菌液體培養(yǎng)物離心后的上清部分代替上述菌懸液進行同樣操作，同時設(shè)以PBS代替菌懸液同樣操作的空白對照。于不同黏附時間取出蓋玻片，用 DHank’s徹底沖洗3次，去除未黏附的細菌，自然干燥。甲醇固定15 min后Giemsa染色，用95%乙醇及無水乙醇脫水，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，高倍鏡下5次隨機選取100個細胞，計數(shù)有細菌黏附的細胞數(shù)及黏附的細菌總數(shù)，并用下述公式計算黏附率和黏附指數(shù):黏附率(%)=(表面有細菌黏附的細胞數(shù)/100)×100%;黏附指數(shù)(細菌數(shù)/每個細胞)=黏附的細菌總數(shù)/100。

1．5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2．1 UPEC毒力基因PCR結(jié)果

以受試菌的染色體DNA為模板，利用papC，hly和cnf1的特異性引物進行PCR和復(fù)合PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，UPEC132和UPEC J96均獲得大小分別為328 bp，1177 bp和498 bp的特異性片段(見圖1)，表明UPEC132具有編碼毒力因子P菌毛，溶血素(Hly)和細胞壞死因子(CNF1)的基因。

圖1 不同菌株毒力基因papC，hly和cnf1的瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of different virulence genes papC，hly and cnf1

2．2 UPEC對人尿路膀胱癌EJ細胞的黏附實驗

分別將試驗菌株UPEC132和 陰性對照菌株E．coli K-12p678-54作用于人膀胱癌EJ細胞，計算不同作用時間后的黏附率和黏附指數(shù)。結(jié)果顯示，E．coli K-12p678-54的細胞黏附率和黏附指數(shù)均為0。UPEC132作用于EJ細胞在15－180 min內(nèi)的黏附率為22．50%－76．30%，隨著時間的延長黏附率逐漸增加，黏附指數(shù)于120 min達到高峰，為43．35±5．63，然后有所下降(見表1)。經(jīng)統(tǒng)計學處理，作用30，60，120和180 min的黏附率和黏附指數(shù)之間無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)，但均明顯高于15 min的結(jié)果(P ＜0．01)。

表1 UPEC132對EJ細胞不同作用時間黏附能力的比較Table 1 Comparison of adhesive ability of UPEC132 to EJ cells at the different time points

圖2 E．coli K-12p678-54菌株感染EJ細胞 (Giemsa，×200)Figure 2 EJ cells infected by E．coli K-12p678-54(Giemsa，×200)

光鏡鏡檢結(jié)果顯示，EJ細胞是一類人尿路移行上皮癌細胞，培養(yǎng)細胞呈上皮樣，具有與上皮細胞相似的特征，但比人正常二倍體細胞的核質(zhì)比例高，鏡下可見胞內(nèi)近中央處有較大且不規(guī)則形細胞核。陰性對照組E．coli K-12p678-54作用于人膀胱癌EJ細胞后其形態(tài)無變化(見圖2)。而UPEC132作用于EJ細胞后，與陰性對照組相比其細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化(見圖3)。黏附后細胞由扁平伸展圓縮為不規(guī)則形狀，胞間連接變得更為松散，細胞間隙增大，Giemsa染色著色不均。油鏡下可見，EJ細胞在感染UPEC132后，胞漿突呈圓形、減少或消失(見圖4A)，部分細胞核內(nèi)出現(xiàn)大量空泡樣變(見圖4B)。部分EJ細胞表面有大量細菌黏附，細胞邊緣分布的細菌使胞膜沿菌體局部凹陷，胞質(zhì)和胞核內(nèi)出現(xiàn)包有菌體的空腔(見圖4C)，部分EJ細胞的胞膜破損(見圖4D)。值得注意的是，用UPEC132液體培養(yǎng)物離心后上清部分感染細胞并無形態(tài)學改變。?

圖3 UPEC132菌株黏附 EJ細胞 (Giemsa，×200)Figure 3 EJ cells adhered by UPEC132(Giemsa，×200)

圖4 EJ細胞被UPEC132菌株粘附后的形態(tài)學改變 (Giemsa，×2 000)Figure 4 Morphological changes of EJ cells adhered by UPEC132(Giemsa，×2 000)

3 討論

尿路感染按解剖部位的不同分為尿道炎、膀胱炎和腎盂腎炎。其中腎盂腎炎較為嚴重，除尿道刺激癥狀外，還出現(xiàn)全身癥狀，而且常常由于用藥不規(guī)則導(dǎo)致細菌極易產(chǎn)生多重耐藥性，病情反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，晚期出現(xiàn)腎功能不全，危及病人生命。一些慢性尿路炎癥(如膀胱黏膜慢性炎癥)還與尿路惡性腫瘤(如膀胱移行上皮細胞癌)的發(fā)生有關(guān)。尿路感染的發(fā)生大多由大腸桿菌引起。因此，對于尿道致病性大腸桿菌致病機制的深入研究不僅豐富微生物學的理論，而且為制定抗尿路感染治療的策略提供新思路。

UPEC具有一系列菌株特異性毒力因子，常常由位于染色體上的致病島基因編碼。絕大多數(shù)UPEC菌株表達Ⅰ型菌毛和P菌毛，與該菌的宿主細胞黏附和內(nèi)在化有關(guān)［6］。此外，細胞壞死因子(CNF1)可增強細胞受體的親和力及細胞骨架肌動蛋白的聚合作用;溶血素(Hly)不僅作用于紅細胞，還作用于腎上皮細胞、內(nèi)皮細胞和免疫細胞等，具有形成細胞孔的活性和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用［7］。經(jīng)血凝試驗、免疫電鏡和papA的序列分析［5］表明UPEC132菌株編碼 P菌毛，與UPEC J96同屬 papA F13型，并具有CNF1和Hly毒力因子。該菌株可以特異性地黏附人腎盂上皮原代細胞，只有菌體直接黏附細胞后才會產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細胞形態(tài)的顯著變化，對其變化的機制有待進一步的研究。

從細菌和宿主細胞相互作用的角度開展病原菌致病機制的研究中必然涉及到細胞感染的模型。曾有報道UPEC與Buffalo猴腎細胞及兔睪丸細胞的研究［8，9］，未見UPEC與人類尿路細胞感染模型的廣泛應(yīng)用。本研究首次成功選用了人膀胱癌EJ細胞進行UPEC細胞黏附的實驗研究，結(jié)果顯示UPEC對EJ細胞有較強的黏附性并對細胞骨架系統(tǒng)產(chǎn)生影響，使被感染細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學改變。EJ細胞雖然為癌細胞，但源于人尿路移行上皮細胞，比上述兩類動物細胞更貼近人體內(nèi)尿路上皮細胞的致病過程，并且可以與UPEC黏附尿路正常移行上皮細胞研究［2，3，10］進行對比，相關(guān)的深入研究仍在進行中。

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