人纖溶酶原絲氨酸蛋白酶(SP)活性區(qū)基因的克隆、表達與功能研究

崔 佳，萬翠香(長治醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，長治 046000;南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;通訊作者，E-mail:cuixiangwan@ncu．edu．cn)

人纖溶酶原(plasminogen，Plg)是由810個氨基酸多肽構(gòu)成的糖蛋白，分子量約92 kD，成熟的Plg包括N端多肽NTP，5個同源的三角區(qū)(K1－K5)及絲氨酸蛋白酶(SP)區(qū)。在堿性條件(pH 11．0)下，纖溶酶限制性降解纖溶酶原Arg530-Lys531位上的肽鍵，特異性降解出由261個氨基酸殘基構(gòu)成的SP區(qū)，即微小纖溶酶原(microplasminogen，μplg)，它完全保留了纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶(SP)活性區(qū)，并可被纖溶酶原激活劑激活后形成微小纖溶酶，具有纖溶活性［1－3］。

Plg的大多數(shù)抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族(serpin superfamily)的成員［3］，包括 α2－ 抗纖溶酶(α2-AP)、PA抑制物(PAI)，它們分別調(diào)控纖溶酶plasmin和Plg激活劑PA。

2006年，瑞士雀巢研究中心預(yù)測并報道了長雙歧桿菌NCC2705中一類具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的外膜蛋白Serpin的存在，推測了Serpin的作用可能是抵抗外源蛋白酶的消化，并為雙歧桿菌在宿主腸道內(nèi)的定植提供一個極其重要而有利的競爭條件［4］。本實驗室在前期的研究工作中已成功從長雙歧桿菌中分離到Serpin外膜蛋白，使之在原核表達體系中大量表達，并且得到了高純度的Serpin蛋白。最新文獻報道，人Plg可與雙歧桿菌一些表面蛋白黏附［5］，然而未有關(guān)于Plg與Serpin表面蛋白相互作用的報道，依據(jù)Plg結(jié)構(gòu)中有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，我們推測Plg也能與雙歧桿菌的Serpin表面蛋白相互作用，并且實驗加以驗證。

1 材料與方法

1．1 菌株與質(zhì)粒

菌株:E．coli．DH5α、BL21(DE3)來源于南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室。質(zhì)粒:pDNR-plg購自于德國Thermo公司、pET22b(+)、T載體購自于TaKaRa公司。

1．2 主要試劑與儀器

EcoRⅠ 和HindⅢ 內(nèi)切酶購自于TaKaRa公司;雙歧桿菌Serpin重組蛋白為南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保存;磁性納米粒子購自于無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司。Ni+-NTA樹脂:Merk公司;PCR儀:Eppendorf公司;離心機:德國Thermo公司;凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad公司。

1．3 pDNR-plg質(zhì)粒提取，μplg基因克隆

上游引物:5'－G GAATTC CTGGAAGGGTTGTAGGG－3'(EcoRⅠ);下游引物:5'－CCC AAGCTT CTCAATCCAAGTAACAAACC－3'(HindⅢ)。

使用2×μpfu Mix通過PCR從pDNR-plg中擴增到目的片段μplg基因，然后加Poly A尾連接至pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)入E．coli DH5α，篩選陽性克隆子測序。測序正確的克隆子經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切得到目的片段，電泳檢測后用DNA片段回收試劑盒進行目的片段回收，再與表達載體pET22b(+)連接構(gòu)建重組表達載體pET22b(+)-μplg，挑取陽性重組子，雙酶切及測序驗證正確后，轉(zhuǎn)入表達宿主E．coli BL21，備用。

1．4 μPlg蛋白的表達

將轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E．coli BL21獲得的重組子單菌落接種至新鮮的2 ml LB/Amp培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)初期轉(zhuǎn)接至150 ml LB/Amp培養(yǎng)基中，對數(shù)初期加入終濃度為0．2 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達3 h，離心洗滌收集菌體后，采用超聲波破碎菌體，分離上清和沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。同時參考文獻［6］以攜帶 pET22b(+)的 E．coli BL21非重組子作為對照。

1．5 μPlg蛋白的復(fù)性與純化

SDS-PAGE檢測μPlg蛋白主要在沉淀中以包涵體形式存在，6 mol/L尿素溶解后進行包涵體蛋白復(fù)性，透析緩沖液選用20 mmol/L Tris-HCl，透析2－3 d，每4 h換液1次［7］，透析完成后進行SDS-PAGE檢測透析效果。之后參照Ni+-NTA His·Bind樹脂柱說明書對上清中的分泌型μPlg蛋白進行特異性純化。

1．6 μPlg蛋白與雙歧桿菌Serpin表面蛋白共孵育

參照文獻［8］，μPlg蛋白與10 mg(10 mg/ml)磁性納米粒子在室溫反應(yīng)3 h，4℃過夜，使其充分偶聯(lián)，再與雙歧桿菌的Serpin重組表面蛋白室溫孵育2．5 h，SDS-PAGE電泳檢測孵育結(jié)果。

2 結(jié)果

2．1 重組克隆載體pMD18-T-μplg的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pMD18-T-μplg雙酶切鑒定結(jié)果見圖1所示，在680 bp左右EcoRⅠ和HindⅢ 雙酶切產(chǎn)生1條與目的片段μplg大小相符的條帶，且測序結(jié)果正確，表明目的片段μplg已成功連接入克隆載體pMD18-T。

圖1 pMD18-T-μplg雙酶切驗證電泳圖譜Figure 1 Electrophoresis of recombination plasmid pMD18-T-μplg after double enzyme digest

2．2 重組表達載體pET22b(+)-μplg的構(gòu)建

電泳結(jié)果顯示，選取的重組子質(zhì)粒酶切結(jié)果均切出680 bp左右的條帶(見圖2)，表明目的基因片段μplg已經(jīng)插入到表達載體 pET22b(+)中，送南京金斯瑞公司測序，測序結(jié)果正確。

圖2 pET22b(+)-μplg雙酶切驗證電泳圖譜Figure 2 Electrophoresisofrecombinantplasmid pET22b(+)-μplg digested by EcoRⅠand HindⅢ

2．3 μPlg蛋白的表達

μPlg蛋白的誘導(dǎo)表達結(jié)果見圖3。pET22b(+)-μplg重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達帶與空質(zhì)粒pET22b(+)誘導(dǎo)帶相比，在沉淀中35 kD附近出現(xiàn)一條顯著的蛋白過量表達條帶，與目的蛋白μPlg預(yù)計大小相符，而空質(zhì)粒pET22b(+)未出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶。

圖3 SDS-PAGE檢測μPlg誘導(dǎo)表達結(jié)果Figure 3 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis of the μPlg protein expression

2．4 μPlg蛋白的復(fù)性與純化

將μPlg包涵體融合蛋白用6 mol/L尿素溶解進行復(fù)性，電泳結(jié)果顯示大約有50%的包涵體蛋白經(jīng)復(fù)性后是以可溶的形式存在于上清中。取復(fù)性上清中μPlg蛋白經(jīng)Ni+-NTA His·Bind樹脂柱純化后用SDS-PAGE檢測，電泳結(jié)果顯示250 mmol/L咪唑可以洗下大多數(shù)結(jié)合目的蛋白，純化的條帶清晰且不含雜帶，獲得了高純度的μPlg蛋白(見圖4)。

圖4 μPlg蛋白變性和純化檢測電泳圖譜Figure 4 Electrophoresis of renaturation and purification of μPlg protein

2．5 μPlg蛋白與Serpin蛋白共孵育

將雙歧桿菌Serpin外膜蛋白與磁珠偶聯(lián)的μPlg共孵育，甘氨酸－鹽酸洗脫后出現(xiàn)了一個新的條帶，通過與Marker比較，該蛋白的分子量大約為70 kD(見圖5)，推測其極有可能為Serpin與μPlg結(jié)合物。

圖5 Serpin與μPlg蛋白共孵育后電泳圖譜Figure 5 Electrophoresis of Serpin incubating with μPlg

3 討論

Plg豐富存在于人體的血漿和細(xì)胞外液，其作為酶原轉(zhuǎn)化為具有活性的plasmin，對于溶解纖維蛋白、降解胞外基質(zhì)起重要作用。本實驗對Plg 6個結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域SP區(qū)即μplg進行了克隆表達，目的蛋白大部分在沉淀中以包涵體的形式存在，其原因可能為:Plg來源于真核生物，在大腸桿菌原核表達體系中不能夠正確折疊，因此很難形成可溶性蛋白［9］。為此，選擇蛋白質(zhì)復(fù)性來獲得可溶性μPlg蛋白，電泳顯示，蛋白的復(fù)性率大約為50%。

由于Plg蛋白結(jié)構(gòu)中含有絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)域SP區(qū)，且大多數(shù)Plg抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)超家族的成員，因此推測μPlg很可能與Serpin發(fā)生特異性結(jié)合。近年來，雙歧桿菌的外膜蛋白在黏附定植腸黏膜表面，阻止病原菌的入侵方面發(fā)揮著重要作用［10，11］，而 Serpin作為雙歧桿菌一種重要外膜蛋白也陸續(xù)在很多菌種中發(fā)現(xiàn)［1，6，12，13］，并推測其在腸道的炎癥部位可能減弱蛋白酶的效應(yīng)進而起到保護菌體的作用，但是關(guān)于Serpin在腸道內(nèi)參與雙歧桿菌黏附定制的機制則研究甚少。本研究將純化到的μPlg與實驗室前期制得的Serpin通過磁珠法共孵育，結(jié)果得到了一個約70 kD蛋白復(fù)合物，初步推斷二者可發(fā)生相互作用，這表明人類的Plg蛋白可能是雙歧桿菌黏附的一個特異性受體。人體Plg在腸道微生物菌體的表面招募，賦予了菌體潛在的代謝能力，更加有利于菌體的定植［5，14，15］。

本實驗所用到的磁珠法在研究配體和受體的作用、分離篩選生物活性物質(zhì)等方面具有廣泛的應(yīng)用。磁性納米粒子通過表面修飾提供足夠多的結(jié)合位點與一種生物分子結(jié)合，進而去捕獲、識別另一種相互作用的生物組分，然后在外加磁場的作用下快速實現(xiàn)富集、濃縮、純化［16，17］?；诂F(xiàn)在的研究，磁珠偶聯(lián)配體尋找目的蛋白的方法對益生菌功能蛋白篩選具有方法學(xué)指導(dǎo)意義，今后還可以將此偶聯(lián)有Plg蛋白的磁珠與其他活性物質(zhì)相互連接，進一步探究人類纖溶酶原的生物學(xué)功能。

［1］Zhang L，Seiffert D，F(xiàn)owler BJ，et al．Plasminogen has a broad extrahepatic distribution［J］．Thromb Haemost，2002，87(3):493－501．

［2］宋鋼．人纖溶酶原結(jié)構(gòu)和功能研究進展［J］．國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，1999，27(1):39－42．

［3］Castellino FJ，Ploplis VA．Structure and function of the plasminogen/plasmin system［J］．Thromb Haemost，2005，93(4):647－654．

［4］Ivanov D，Emonet C，F(xiàn)oata F，et al．A Serpin from the gut bacterium Bifidobacterium longum inhibits eukaryotic elastase-like serine proteases［J］．J Biol Chem，2006，281(25):17246－172．

［5］Candela M，Bergmann S，Vici M，et al．Binding of human plasminogen to Bifidobacterium［J］．J Bacteriol，2007，189(16):5929－5936．

［6］崔佳，萬翠香，楊友均，等．Serpin的多抗制備和產(chǎn)Serpin的雙歧桿菌菌株的初步篩選［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2011，30(6):934－939．

［7］趙喜紅，何小維，李文美，等．大腸桿菌表達包涵體蛋白體外復(fù)性研究進展［J］．食品工業(yè)科技，2010，31(6):379－383．

［8］徐鋒，彭珍，萬翠香，等．高特異性長雙歧桿菌多克隆抗體的制備［J］．中國生物制品學(xué)雜志，2010，23(2):182－184．

［9］謝磊，孫建波，張世清，等．大腸桿菌表達系統(tǒng)及其研究進展［J］．華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，10(2):16－20．

［10］Riedel CU，F(xiàn)oata F，Philippe D，et al．Anti-inflammatory effects of Bifidobacteria by inhibition of LPS-induced NF-kappaB activation［J］．World J Gastroenterol，2006，12(23):3729－3735．

［11］Preising J，Philippe D，Gleinser M，et al．Selection of Bifdobacteria based on adhesion and anti-Infammatory capacity in vitro for amelioration of murine colitis［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76(9):3048－3051．

［12］Turroni F，F(xiàn)oroni E，Motherway MO，et al．Characterization of the serpin-encoding gene of Bifidobacterium breve 210B［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76(10):3206－3219．

［13］葉若松，黎鵬，章昭琳，等．兩歧雙歧桿菌中serpin基因的克隆、表達與功能分析［J］．中國生物工程雜志，2011，32(2):38－42．

［14］Candela M，Miccoli G，Bergmann S，et al．Plasminogen-dependent proteolytic activity in Bifidobacterium lactis［J］．Microbiology，2008，154(Pt8):2457－2462．

［15］Candela M，Biagi E，Centanni M，et al．Bifidobacterial enolase，a cell surface receptor for human plasminogen involved in the interaction with the host［J］．Microbiology，2009，155(Pt10):3294－3303．

［16］Gu H，Ho PL，Tsang KW，et al．Using biofunctional magnetic nanoparticles to capture vancomycin-resistant Enterococci and other gram-positive bacteria at ultralow concentration［J］．J Am Chem Soc，2003，125(51):15702－15703．

［17］Gantelius J，Hartmann M，Schwen JM，et al．Magnetic bead-based detection of autoimmune responses using protein microarrays［J］．Nat Biotechnol，2009，26(6):269－ 276．