乳清蛋白肽的酶法制備、分離純化及活性評價*

任嬌艷　賴婷　江燕清　盧韻君　劉鵬　廖文鎮(zhèn)

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

乳清蛋白肽的酶法制備、分離純化及活性評價*

任嬌艷賴婷江燕清盧韻君劉鵬廖文鎮(zhèn)

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

摘要：以抗氧化活性及蛋白質(zhì)回收率為篩選指標(biāo)對乳清蛋白肽酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，用層析柱對酶解液進(jìn)行逐級分離純化，并對其分子質(zhì)量進(jìn)行檢測.研究結(jié)果表明：利用胰酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解制備乳清蛋白肽，最佳用酶為堿性蛋白酶、最適底物含量為4.0%、最適加酶量為8000U/g、最佳酶解時間為4h；酶解液經(jīng)DEAE-52纖維素層析后得到的A組分抗氧化活性最好，其還原力為0.3200±0.0041，DPPH自由基清除率為6.58%±0.36%；A組分再經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱分離純化后得到組分G，其DPPH自由基清除率為6.73%±0.083%；組分G的主要成分為分子質(zhì)量378u的肽段，其一級氨基酸組成為賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)及絲氨酸(Ser).

關(guān)鍵詞：乳清蛋白；酶解；分離；純化；活性評價；DEAE-52離子交換柱層析；Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱層析

乳清蛋白是將牛乳的pH值降低至4.6，沉淀去除酪蛋白后保留在上清液中的多種蛋白質(zhì)組分的總稱，占牛乳總蛋白的20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右，包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛乳血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白及乳過氧化物酶等[1-2]，且富含必需氨基酸，是一類營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白.乳清蛋白具有蛋白含量高，脂肪、膽固醇和乳糖含量低的特點，且易消化吸收，具有較高的營養(yǎng)價值[3-4].

生物活性肽源于蛋白質(zhì)，是對生物體的生命活動有重要調(diào)節(jié)作用的肽類化合物，具有吸收快、效率高等特點.酶解法是目前制備生物活性肽最常見、有效的方法，該方法具有生產(chǎn)條件溫和、水解條件易控制且水解產(chǎn)物安全性較高等特點.隨著目前乳源活性肽的研究與相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，大量研究證明乳清蛋白中含具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗菌、抗氧化及抗病毒等生物活性的肽段[5-9].Castro等[10]研究了不同濃度的乳清分離蛋白對B16F10黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)較低濃度的乳清分離蛋白有利于抑制癌細(xì)胞增殖;Pea-Ramos等[11]將乳清分離蛋白的水解物加到熟豬肉餅中，由Protamex酶解的乳清蛋白的抗氧化性顯著提高，抑制了共軛二烯和TBARS等脂類氧化中間產(chǎn)物的形成；Ferreira等[12]用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制備了ACE抑制肽，并利用PR-HPLC分離得到了肽段ALPMHIR，具有較好的降血壓活性.目前關(guān)于乳清蛋白的研究多集中在乳清蛋白成分分析[13]、乳清多肽的制備[14-15]、酶解工藝及抗氧化活性[15-16]等方面，對其分離純化及分子質(zhì)量測定的研究相對較少.

本研究以WPC80濃縮乳清蛋白粉為原料，酶解制備乳清蛋白肽，并利用控制變量法對乳清蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高乳清蛋白的蛋白質(zhì)回收率及利用率；之后，將乳清蛋白酶解物過DEAE-52纖維素離子交換柱和Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱，對乳清蛋白酶解物進(jìn)行逐級分離純化，并對分離純化后組分進(jìn)行分子質(zhì)量分析，初步確定乳清蛋白肽一級氨基酸序列組成.

1材料和方法

1.1材料與試劑

WPC80濃縮乳清蛋白粉，產(chǎn)地為美國哥倫比亞，購自廣州市比靈天然配料有限公司；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶和堿性蛋白酶，購自南寧龐博生物工程有限公司；DEAE-52纖維素層析柱填料、Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱填料，購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質(zhì)，購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；乙腈，購自瑞典Pharmacia公司；標(biāo)準(zhǔn)混合多肽，購自德國Bruker公司;2,2-Diphenyl-1-picrylhdrazyl(DPPH)，購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白，購自上海伯奧生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純；去離子水為實驗室自制.

1.2儀器與設(shè)備

KDN-1型自動凱氏定氮儀，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；HYP-1020 消化爐，上海書培實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；PHS-3C 型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn)；HL-2B 數(shù)顯恒流泵、BS-100A自動部分收集器，上海瀘西分析儀器廠有限公司生產(chǎn)；752N 紫外-可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；4800 Plus MALDI TOF/TOF Mass質(zhì)譜儀，(ABI)美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn).

1.3實驗方法

1.3.1酶解工藝條件篩選

稱取適量乳清蛋白，按一定比例加入去離子水，混合均勻后置于50℃水浴鍋中預(yù)熱30min，按不同加酶量(U/g,以每克乳清蛋白為基準(zhǔn)計)分別加入各種蛋白酶，酶解溫度為50℃，在各酶最適pH值條件下(胰酶：2×105U/g，pH=8.0;復(fù)合風(fēng)味蛋白酶：2×105U/g ，pH=7.0；木瓜蛋白酶：2×105U/g ，pH= 7.0；堿性蛋白酶：2×105U/g ，pH =9.0)進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后于100℃煮沸10min滅酶，然后于4℃、8000r/min下離心20min，過濾，收集上清液，于4℃冰箱中保存.

1.3.1.1最適水解酶的篩選

按上述酶解工藝，在乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.0%、加酶量為8000U/g的條件下，分別加入胰酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，在其最適pH值條件下，酶解4h，離心后收集上清液待測，選擇最適水解酶.

1.3.1.2最適乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的篩選

按上述酶解工藝，以堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，設(shè)計乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，加酶量為8000U/g，酶解4h，離心后收集上清液待測，選擇最適乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.3.1.3最適加酶量的篩選

按上述酶解工藝，設(shè)計加酶量分別為4000、6000、8000、10000和12000U/g，以堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，酶解4h，離心后收集上清液待測，選擇最優(yōu)加酶量.

1.3.1.4最適酶解時間的篩選

按上述酶解工藝，以堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，加酶量為8000U/g，設(shè)計酶解時間分別為4、8、12h，離心后收集上清液待測，探究最優(yōu)酶解時間.

1.3.2蛋白質(zhì)回收率測定

采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5—85，分別測定原料蛋白質(zhì)質(zhì)量、酶解液的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酶解后上清液質(zhì)量，按下式計算蛋白質(zhì)回收率(H)：

式中：C為酶解液蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；M為酶解離心過濾后上清液的質(zhì)量，g；m為原料蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g.

1.3.3DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率的測定參照文獻(xiàn)[17]的方法.用2mL去離子水與2mL 95%乙醇溶液混合后進(jìn)行調(diào)零；取2mL DPPH溶液(0.2mmol/L)置于試管中，加入2mL樣品液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30min，在波長517nm處測定吸光值，記為Ai；將2mL樣品液與2mL 95%乙醇的混合液作為對照樣，在波長517nm處測定吸光值，記為Aj；用2mL DPPH溶液與2mL 95%乙醇的混合液作為空白樣，在波長517nm處測定吸光值，記為Ac.DPPH自由基清除率按下式計算：

1.3.4還原力測定

還原力測定參照文獻(xiàn)[18]的方法并有所改良.取溶解在磷酸鹽緩沖液(0.2mmol/L，pH=6.6)中的多肽樣品2mL，與2mL磷酸鹽緩沖液(0.2mmol/L，pH=6.6)混合振勻，加入2mL鐵氰化鉀溶液(1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，混勻后于50℃保溫20 min；之后加入2mL 三氯乙酸(10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，于3000r/min離心10min；離心后取上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL 氯化鐵溶液(0.1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))并混勻，10min后測定其在700nm處的吸光值，記為A1.空白對照為以緩沖液代替樣品溶液，700nm處的吸光值記為A0.還原力按下式進(jìn)行計算：

還原力=A1-A0.

1.3.5DEAE-52纖維素層析柱分離純化

DEAE-52纖維素填料經(jīng)0.5mol/L的鹽酸浸泡、去離子水沖洗、0.5mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡、去離子水沖洗等步驟進(jìn)行預(yù)處理后裝柱.稱取4~5g乳清蛋白酶解液(約合160~200mg多肽)上樣，依次用3種流動相進(jìn)行梯度洗脫：去離子水、0.1mol/L的 NaCl溶液及0.3mol/L的 NaCl溶液，設(shè)定分離流速為0.5mL/min，自動部分收集器收集洗脫液.將收集的分離液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，用雙縮脲法[19]測定各組分的蛋白質(zhì)含量.

1.3.6Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱分離純化

將經(jīng)DEAE-52分離后的組分進(jìn)一步用Sephadex G-15分離純化.稱取6~8mL樣品沿柱內(nèi)壁緩慢加入后，以0.5mL/min的流速加入去離子水進(jìn)行洗脫；使用自動部分收集器進(jìn)行收集，收集液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后，測定分離組分的抗氧化活性.

1.3.7MALDI-TOF-MS分析[20]

配制乙腈-超純水混合液(其中乙腈與超純水的體積比為1：1，TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.1%)作為溶劑備用，將CHCA溶于上述溶劑中，制成飽和溶液，離心，取上清液得到基質(zhì)溶液.將標(biāo)準(zhǔn)混合多肽和樣品分別與基質(zhì)溶液按體積比1：1混合均勻，取1μL滴在MALDI靶板上，于室溫自然干燥后，將樣品板放進(jìn)離子源中進(jìn)行測定，累計10次單次掃描信號為最終質(zhì)譜圖.

1.3.8統(tǒng)計分析

文中數(shù)據(jù)均為3次平行測定值的平均值.利用軟件Excel 2007及Origin 8.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)及繪圖，在顯著性水平P=0.05下，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，結(jié)果表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式.

2結(jié)果與分析

2.1最佳酶解工藝條件的篩選結(jié)果

2.1.1最佳水解酶的篩選結(jié)果

經(jīng)不同酶酶解得到的酶解液的還原力、DPPH自由基清除率和蛋白質(zhì)回收率如表1所示.

表 1不同酶解液的還原力、DPPH自由基清除率和蛋白質(zhì)回收率1)

Table 1Reducing power,DPPH radical scavenging activity and protein recovery of different protein hydrolysates

水解用酶酶解液質(zhì)量濃度為10g/L時的還原力酶解液質(zhì)量濃度為5g/L時的DPPH自由基清除率/%蛋白質(zhì)回收率/%胰酶0.27±0.01b13.46±0.18c71.32±1.62c復(fù)合風(fēng)味蛋白酶0.35±0.01a15.64±0.36bc74.55±0.39c木瓜蛋白酶0.27±0.01b18.46±1.09b84.25±0.66a堿性蛋白酶0.35±0.02a24.64±1.18a79.89±0.09b

1)各列中不同上標(biāo)字母(a-c)表示差異顯著(P<0.05).

由表1 可知:以不同的酶酶解得到的乳清蛋白酶解液在質(zhì)量濃度為10g/L時，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶酶解液的還原力(還原力活性以吸光值進(jìn)行表征)最高，吸光值均達(dá)到0.35，顯著高于其他酶解液(P< 0.05)；當(dāng)各酶解液質(zhì)量濃度為5g/L時，堿性蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率最高，亦顯著高于其他酶解液(P< 0.05)；就蛋白質(zhì)回收率而言，木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解液相對較高.綜合還原力和DPPH自由基清除率來看，經(jīng)堿性蛋白酶酶解后的乳清蛋白酶解液具有最高的活性，再以蛋白質(zhì)回收率作為輔助篩選指標(biāo)，最終選擇堿性蛋白酶為乳清蛋白的最適水解用酶.

2.1.2最適乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量及酶解時間的篩選結(jié)果

不同酶解條件對酶解液蛋白質(zhì)回收率的影響如圖1所示.

由圖1(a)可知:當(dāng)乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%及4.0%時，乳清蛋白酶酶解液的蛋白質(zhì)回收率較高，為84%左右，兩者無顯著性差異(P> 0.05)；當(dāng)乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于4.0 %時，乳清蛋白酶酶解液的蛋白質(zhì)回收率隨著乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而不斷降低，當(dāng)乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.0%時，酶解液的蛋白質(zhì)回收率降到40%左右.由于隨著乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，酶反應(yīng)速率不斷增加，當(dāng)乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%和4.0%時，蛋白質(zhì)回收率無顯著性差異，故選擇乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，以獲得更高的酶反應(yīng)速率.

(a)乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白質(zhì)回收率的影響

(b)加酶量對蛋白質(zhì)回收率的影響

(c)酶解時間對蛋白質(zhì)回收率的影響圖1　不同酶解條件對酶解液蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.1　Effect of different hydrolysis conditions on protein recovery

由圖1(b)可知:當(dāng)加酶量為4000和6000U/g時，酶解液的蛋白質(zhì)回收率無顯著性差異(P> 0.05)，隨加酶量的增加，酶解液的蛋白質(zhì)回收率持續(xù)增加，當(dāng)加酶量為8000U/g時，蛋白質(zhì)回收率達(dá)到最大，為82%左右，顯著高于其他樣品(P< 0.05).加酶量繼續(xù)增加時，酶解液的蛋白質(zhì)回收率呈下降再上升趨勢，但均未超過加酶量為8000U/g時的蛋白質(zhì)回收率.因此，選擇8000U/g為最適加酶量.

由圖1(c)可知，隨酶解時間的延長，乳清蛋白酶酶解液的蛋白質(zhì)回收率呈先增加再降低的趨勢，當(dāng)酶解時間為4h時，酶解液的蛋白質(zhì)回收率達(dá)到最大，為82%左右，顯著高于其他酶解液(P< 0.05)，這是因為當(dāng)酶解時間小于4h時，底物未酶解完全，而超過4h后，底物徹底酶解，故繼續(xù)增加酶解時間對蛋白質(zhì)回收率無顯著影響.故選擇4h為最適酶解時間.

綜上所述，篩選出堿性蛋白酶為最佳水解酶，最適乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，最適加酶量為8000U/g，最佳酶解時間為4h.

2.2乳清蛋白肽的分離純化及活性鑒定

2.2.1DEAE-52纖維素層析柱分離純化乳清蛋白肽及其活性鑒定

利用DEAE-52層析柱對乳清蛋白進(jìn)行初步分離，分離的洗脫圖如圖2所示，管號1-100的洗脫液為去離子水，管號101-200的洗脫液為0.1mol/L的NaCl溶液，管號201-300的洗脫液為0.3mol/L的NaCl溶液，洗脫速度均為0.5mL/min.

圖 2　乳清蛋白酶解物的DEAE-52洗脫圖Fig.2　Separation profile of whey protein hydrolysates on DEAE-52 column

由圖2可知，經(jīng)去離子水、0.1mol/L的 NaCl溶液及0.3mol/L的NaCl溶液洗脫后得到3個峰，收集管號15-55的洗脫液合并，濃縮后得到乳清蛋白肽A組分；收集管號119-215的洗脫液合并，濃縮后得到乳清蛋白肽B組分；收集管號220-255的洗脫液合并，濃縮后得到乳清蛋白肽C組分.分離后的A、B、C組分的蛋白質(zhì)量濃度分別為2.49、6.75和1.33g/L.當(dāng)3個組分的蛋白質(zhì)量濃度均為1g/L時，其抗氧化活性(還原力及DPPH自由基清除率)檢測結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，當(dāng)3個組分的蛋白質(zhì)量濃度均為1g/L時，A組分的還原力最高，即抗氧化活性最強(qiáng)，吸光值為0.3200±0.0041，與其他兩個組分的吸光值有顯著性差異(P< 0.05)；當(dāng)3個組分的蛋白質(zhì)量濃度均為1g/L時，組分A和組分B的DPPH自由基清除率無顯著性差異(P>0.05)，均高于組分C.綜上，組分A較組分B、C具有更好的抗氧化活性，故選擇組分A進(jìn)一步用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)行分離純化.

圖3　不同組分的還原力活性和DPPH自由基清除率Fig.3　Reducing power assay and DPPH radical scavenging activity of different fractions

2.2.2Sephadex G-15 葡聚糖凝膠層析柱分離純化乳清蛋白肽及其活性鑒定

以去離子水為洗脫液對乳清蛋白肽組分A溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.5mL/min，經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱分離后，洗脫圖如圖4所示.

圖4　乳清蛋白肽組分A的Sephadex G-15洗脫圖Fig.4　Separation profile of whey peptides fraction A on Sephadex G-15 column

由圖4可知，用去離子水洗脫得到一個目標(biāo)峰，即經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱分離后，得到相對較純的乳清蛋白肽.收集管號18-80的洗脫液合并，濃縮后得到乳清蛋白肽組分G，測得其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1.79g/L.由于乳清蛋白肽組分A對DPPH自由基清除能力較為敏感，且DPPH自由基較穩(wěn)定，故實驗中測定物質(zhì)的DPPH自由基清除率具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，因此用DPPH自由基清除率評價經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱分離后的乳清蛋白肽組分G，并將其與乳清蛋白肽A組分做比較.DPPH自由基清除率如圖5所示.

圖5　乳清蛋白肽組分A和G的DPPH自由基清除率Fig.5　DPPH radical scavenging activity of whey protein peptides A and G

由圖5可知，經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱分離后的組分G的DPPH自由基清除率為6.730% ± 0.083%，與乳清蛋白肽組分A的DPPH自由基清除率無顯著性差異(P> 0.05)，即乳清蛋白肽組分A和G均具有最好的抗氧化活性，進(jìn)一步分離純化并未降低乳清蛋白肽的抗氧化活性.

2.3乳清蛋白肽的結(jié)構(gòu)鑒定

乳清蛋白肽組分G及基質(zhì)溶液的MALDI-TOF-MS一級質(zhì)譜圖如圖6所示.

(a)組分G

(b)基質(zhì)溶液圖6　組分G及基質(zhì)溶液的MALDI-TOF-MS一級質(zhì)譜圖Fig.6　MALDI-TOF/MS spectrum of fraction G and the matrix solution

由圖6可知，圖譜中有10個主要的質(zhì)子峰，信號最強(qiáng)的質(zhì)子峰對應(yīng)的m/z為378.801，其他3個較強(qiáng)信號的質(zhì)子峰對應(yīng)的m/z分別為425.017、538.295和611.343，說明組分G中的多肽分子質(zhì)量均小于700u，且組分G中的主要成分為分子質(zhì)量 378u的肽段，結(jié)合氨基酸分析推測其一級氨基酸組成為賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)及絲氨酸(Ser).

3結(jié)論

文中對乳清蛋白肽酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，用層析柱對酶解液進(jìn)行逐級分離純化，并對其分子質(zhì)量進(jìn)行檢測,得出以下主要結(jié)論：

(1)制備乳清蛋白肽最佳用酶為堿性蛋白酶，最適乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，最適加酶量為8000U/g，最佳酶解時間為4h.

(2)用DEAE-52纖維素離子交換柱對乳清蛋白酶解物進(jìn)行分離純化后，得到A、B、C3個組分，其中組分A抗氧化活性最高.

(3)選取組分A進(jìn)行Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱分離純化，分離所得組分G進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測，得出乳清蛋白肽中抗氧化活性較高的肽段分子質(zhì)量集中在300~700u，結(jié)合氨基酸分析推測其一級氨基酸組成為Lys、Leu及Ser.

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文章編號：1000-565X(2015)02-0001-07

收稿日期：2014-08-05

*基金項目：廣東省自然科學(xué)杰出青年基金資助項目 (S2013050013954)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-13-0213)；廣東省科技計劃項目(2013B010404001)；農(nóng)業(yè)部重點實驗室開放基金資助項目(NYJG201402)

Foundation items： Supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province for Distinguished Young Scholars(S2013050013954),Program for New Century Excellent Talents in University of Ministry of Education of China(NCET-13-0213)and the Science and Technology Project Item of Guangdong Province(2013B010404001)

作者簡介：任嬌艷(1980-)，女，博士，教授，主要從事食品生物化學(xué)、食品營養(yǎng)與健康等研究.E-mail: jyren@scut.edu.cn

中圖分類號：TS252.9

doi：10.3969/j.issn.1000-565X.2015.02.001

Enzymatic Preparation, Separation, Purification and Antioxidant
Activity Evaluation of Whey Protein Peptides

RenJiao-yanLaiTingJiangYan-qingLuYun-junLiuPengLiaoWen-zhen

(School of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong,China)

Abstract:Whey protein peptides were prepared via enzymolysis, and the corresponding conditions were optimized by taking antioxidant activity and protein recovery as two indicators. Then, the enzymatic hydrolysate was separated and purified by means of column chromatography, and the molecular mass of the product was measured. The results indicate that (1) alkaline protease is more suitable for the enzymolysis than trypsogen, flavorzyme and papain, with an optimal substrate dosage of 4.0%, an optimal enzyme dosage of 8000U/g and an optimal enzymolysis time of 4h; (2) fraction A obtained by DEAE-52 cellulose column chromatography exhibits the highest antioxidant activity, with a reducing power value of 0.3200±0.0041 and a DPPH radical scavenging activity of 6.58%±0.36%; (3) further separation of fraction A via Sephadex G-15 gel column chromatography helps to obtain fraction G with a DPPH radical scavenging activity of 6.73%±0.083%; and (4) the main component identified from fraction G, which contains three amino acids (namely Lys, Leu and Ser), is of a molecular mass of 378u.

Key words:whey protein; enzymolysis; separation; purification; activity evaluation; DEAE-52 ion exchange column chromatography; Sephadex G-15 gel filtration chromatography