紅茶菌發(fā)酵精制茶皂素的工藝研究

王靜，梁慧玲，楊秀芳*， 涂云飛

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶資源跨界應用技術重點實驗室，浙江杭州 310016）

茶皂素（Tea Saponin），又稱茶皂甙，是一類天然糖甙化合物，主要由配基（C30H50O6）、糖體和有機酸的基本結構構成的一種五環(huán)三萜類皂素。油茶餅粕中茶皂素含量較高，達10%～15%，是茶皂素的一個重要來源[1]。茶皂素具有較強的發(fā)泡、乳化、分散、濕潤等作用，是一種性能優(yōu)良的非離子表面活性劑，可廣泛應用于日化、醫(yī)藥、建材、農藥以及其它一些領域，經濟價值較高[2]。

茶皂素的早期提取是以水為溶劑 （稱水浸法），水浸法所得茶皂素純度低，顏色深，黏度大，純度不高，限制了茶皂素的應用[3]。目前茶皂素的提取多采用醇提法[4]或有機溶劑提取法[5]。

紅茶菌是用糖茶水為原料，經過乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等微生物共同發(fā)酵，而制成的酸甜味飲料。在紅茶菌中含有的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等微生物共同作用下，可將可溶性的多糖轉變成為菌膜，因此紅茶菌的發(fā)酵過程會使原料液中的糖類成分含量下降而轉變成為較易去除的菌膜。同時，根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，茶籽餅粕水溶液中接種紅茶菌發(fā)酵后，對茶皂素具有絮凝沉淀的作用。因此在茶籽餅粕中接種紅茶菌進行發(fā)酵，有望開發(fā)成一種精制茶皂素的新方法。

本研究采用正交實驗，對培養(yǎng)方式、發(fā)酵時間、種子液量和發(fā)酵液濃度四個因素進行分析，同時也對精制后的茶皂素進行了薄層層析和品質鑒定，最后結合獲得的最佳發(fā)酵條件，使用80%乙醇進一步浸提，獲得純度較高、顏色較淺的茶皂素。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

茶籽餅粕：購自新昌縣益生茶業(yè)科技有限公司，茶皂素含量約為25%；茶皂素粗品：純度約為50%，市售；紅茶菌：浙江省茶資源跨界應用重點實驗室保留菌種；濃硫酸，無水乙醇，甲醇，香草醛，乙酸乙酯，α-萘酚，醋酸鉛，醋酸酐和正丁醇：均為分析純。

1.2 實驗設備

AL-204型電子天平，梅特勒-托利儀器 （上海）有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏試驗設備有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；ZHWY-2012C型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；LD-IIB型低速離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.3 正交設計

由于茶皂素具有一定的抑菌作用，因此濃度較高的茶皂素可能會抑制紅茶菌的生長[6]。預實驗研究發(fā)現(xiàn)10%的茶籽餅粕水提液（離心去除沉淀）接種紅茶菌后，發(fā)酵情況較好，因此正交實驗設計了三個不同的茶籽餅粕水提液濃度，分別為8%、10%和12%，實驗中所使用的培養(yǎng)基體積均為50 mL。本實驗較之前的研究加大了紅茶菌的接種量，分別加入紅茶菌種子液10 mL、20 mL 和30 mL，因此猜測對茶皂素的絮凝沉淀會更快達到平衡，設立了24 h 和48 h 兩個發(fā)酵時間。紅茶菌為一類好氧菌，之前研究均使用靜置培養(yǎng)（利于形成菌膜），本研究中采用了兩種培養(yǎng)方式，搖床和靜置培養(yǎng)兩種方式。正交因素水平表如表1所示。

茶籽餅粕接種紅茶菌液后在28℃下培養(yǎng)。

在前期研究中，分別對發(fā)酵一段時間之后的上清液及沉淀中的茶皂素含量進行了測定，結果表明95%以上的茶皂素存在于絮凝沉淀中。因此在本研究中，發(fā)酵結束后，去除菌膜，離心取沉淀，并測定沉淀的干重作為衡量指標。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Orthogonaldesign

1.4 茶皂素的測定方法

茶皂素的測定方法采用香草醛-硫酸法[7]。

1.5 組分比較

對所制得的茶皂素定性鑒定采用硅膠薄層層析技術，展呈體系為乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=3∶2∶5∶10 的上相，展呈完畢用5%的濃硫酸乙醇溶液噴霧顯色，對微生物精制所得茶皂素與市售茶皂素粗品進行比較。

1.6 定性鑒定

Molish 反應[8]：配制好一定濃度的油茶皂素溶液，取少許于比色管中，滴加少量10%α-萘酚乙醇溶液，將比色管適當傾斜后小心注入濃硫酸，然后觀察液面的分層處是否出現(xiàn)紫紅色的現(xiàn)象。

Libermann Burchard 反應[8]：取少許油茶皂素粗品，置于比色管中，加入5 mL 醋酐，再添加幾滴濃硫酸進行反應，觀察顏色的改變。

沉淀反應[8]：取配制好的油茶皂素溶液少量加入醋酸鉛，振蕩后看是否有沉淀產生。

1.7 乙醇沉淀進一步精制

使用正交實驗所得的優(yōu)化發(fā)酵條件，進行茶皂素的生物精制，所得的絮凝沉淀部分隨后使用乙醇進行進一步的精制。根據(jù)預實驗發(fā)現(xiàn)，80%的乙醇對于茶皂素的精制效果最佳，因此后續(xù)研究使用80%的乙醇作為進一步精制的提取劑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)應用Excel 2007 軟件分析，正交實驗由Matlab 設計。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果

根據(jù)正交實驗所得到茶皂素沉淀量分析結果如表2所示。四個因素對茶皂素沉淀量的影響因素大小排序為：D 發(fā)酵液濃度＞B 發(fā)酵時間＞C種子液量＞A 培養(yǎng)方式。

表2 正交實驗結果分析Table 2 The result and analysis of orthogonal experiments

表3 正交實驗極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiments

根據(jù)之前的研究表明，溶液中95%的茶皂素會被紅茶菌絮凝沉淀，因此為了獲得較大量的茶皂素，茶皂素的沉淀較多為宜。由表3可以看出，A1（搖床培養(yǎng)）、B2（發(fā)酵 48 h）、C3（接種種子液量30 mL）和D3（發(fā)酵液濃度12%）條件下可以獲得的茶皂素沉淀含量最大。在實驗過程，由于搖床培養(yǎng)會造成紅茶菌菌膜難以形成，離心也難以去除，且經實驗結果表明，培養(yǎng)方式對于茶皂素沉淀的影響較小，因此靜置培養(yǎng)可能較為適合。

2.2 茶皂素組分分析

微生物精制茶皂素與市售茶皂素薄層層析結果如圖1所示，微生物精制的茶皂素成分組成與市售茶皂素粗品基本一致，表明紅茶菌發(fā)酵，對茶皂素的結構并無影響。

圖1 微生物精制茶皂素與市售粗品硅膠薄層層析比較Fig.1 The comparison of thin layer chromatography between purification and crudetea saponin

2.3 茶皂素定性鑒定

茶皂素品質鑒定結果如表4 和圖2所示，微生物精制的茶皂素和市售的茶皂素粗品品質保持一致，表明微生物發(fā)酵不會改變茶皂素的品質。

表4 品質鑒定實驗結果Table 4 The results of characterization tests

圖2 精制茶皂素與市售茶皂素粗品的品質鑒定比較Fig.2 The comparison of characterization tests between purification and crudetea saponin

2.4 乙醇進一步精制結果

使用正交實驗所得的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵，所獲得的發(fā)酵液離心后獲得的茶皂素絮凝沉淀使用80%的乙醇進行進一步純化，所得茶皂素含量及純度如表5所示，精制后經噴霧干燥后的成品如圖3所示。結果表明，經微生物發(fā)酵后，進一步采用80%的乙醇精制，可獲得85%左右純度的茶皂素。從圖3 中可以看出，精制后的茶皂素色澤較淺。

表5 經80%乙醇進一步純化后茶皂素得率和純度Table 5 The yield and purity of tea saponin with 80%ethanol purified

圖3 微生物精制茶皂素與市售粗品顏色比較Fig.3 The comparison of color between purification and crudetea saponin

3 討論

茶皂素是一種天然表面活性劑，在醫(yī)藥、日化、農藥等領域都有廣闊的應用前景。紅茶菌作為一種復合益生菌，具有代謝多糖的功效；同時，由于微生物的發(fā)酵，使發(fā)酵液中的pH 值下降，而茶皂素在酸性條件下易沉淀，因此也產生了絮凝、沉淀茶皂素的特點。本研究將紅茶菌接種到茶皂素水溶液中，通過正交實驗，優(yōu)化了紅茶菌在茶皂素水溶液中的發(fā)酵工藝，并已申請發(fā)明專利[9]。結果表明，12%的茶籽餅粕水提液中接種30 mL種子液，靜置的方式培養(yǎng)48 h可以獲得較大量的茶皂素絮凝沉淀。

通過薄層層析及定性鑒定實驗，將微生物發(fā)酵絮凝獲得的茶皂素與市售茶皂素進行了比較，從結果可以看出，微生物發(fā)酵的過程并未對茶皂素的結構及性質產生影響。

隨后進一步采用乙醇浸提的方式精制茶皂素。通過正交所得的最佳發(fā)酵條件下絮凝的茶皂素沉淀粗品，在80%的乙醇提取后純度可達85%左右。

本研究通過微生物發(fā)酵結合乙醇浸提的方式，對茶籽餅粕中的茶皂素進行了精制。在精制過程中避免使用有機試劑，且生產工藝簡單，成本較低，同時也提高了生產過程和產品的安全性，所得產品可在日化等領域廣泛使用。

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