生牛乳中金黃色葡萄球菌的分離鑒定與藥物敏感性分析

王文博　谷曉紅　苑學(xué)霞　李瑞菊　梁京蕓　李鴛鴦

摘要：采用金黃色葡萄球菌測(cè)試片快速篩選的方法，對(duì)采集于陜西省西安市和渭南市20份樣品中S.aureus進(jìn)行分離鑒定及藥物敏感性研究，以了解此地區(qū)生牛乳中S.aureus的污染情況及對(duì)藥物敏感性。結(jié)果表明：S.aureus測(cè)試片可用于大量生牛乳樣品中S.aureus的初篩工作，方便且省力；S.aureus的檢出率為10%；檢出的兩株S.aureus對(duì)青霉素都為耐藥，其中一株對(duì)磺胺異惡唑也表現(xiàn)為耐藥，兩株S.aureus對(duì)復(fù)方新諾明、紅霉素、萬古霉素、氧氟沙星、克林霉素都表現(xiàn)為敏感。牛場(chǎng)應(yīng)根據(jù)藥物敏感性實(shí)時(shí)調(diào)整抗感染藥物的使用方案。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；分離鑒定；藥物敏感性；生牛乳

中圖分類號(hào)：S879.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0092-03

金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭氏陽性病原菌，是引起反芻動(dòng)物乳房疾病最普遍的致病菌，主要表現(xiàn)為奶牛和羊的臨床和亞臨床乳房炎。據(jù)報(bào)道，在奶牛場(chǎng)中，臨床型乳房炎的發(fā)病率為2%～8%，隱性乳房炎的發(fā)病率更高，這種牛生產(chǎn)的生鮮乳是易被S.aureus污染的食品原料，并且S.aureus能產(chǎn)生高溫滅菌不能破壞的腸毒素，將會(huì)嚴(yán)重影響消費(fèi)者的身體健康。因此，對(duì)生牛乳中S.aureus的研究尤其是檢測(cè)非常重要。隨著抗生素的廣泛使用，S.aureus對(duì)目前使用的各種抗生素可能產(chǎn)生一定程度的耐藥，給奶牛乳房炎的治療帶來一定困難，所以及時(shí)掌握S.aureus的耐藥性情況是防治該病的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)以生牛乳為原料，以S.aureus為研究對(duì)象，采用S.aureus測(cè)試片進(jìn)行快速篩選的方法，研究生牛乳中S.aureus的分離鑒定及藥物敏感性，旨在為生牛乳中S.aureus的分離鑒定及藥物敏感性分析提供一種方便、省力的檢測(cè)方法，為及時(shí)防止由S.aureus引起的食源性疾病提供可靠的技術(shù)支持，也為原料奶的安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

生牛乳：采自陜西省西安市和渭南市，共20份樣品。將采集的生牛乳放入冰盒中保存，并在12h內(nèi)分離樣品；S.aureus測(cè)試片：購(gòu)自北京良潤(rùn)生物科技有限公司；S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌株[CMCC（B）26003]：購(gòu)自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心；藥敏測(cè)試盒：購(gòu)白天津金章科技發(fā)展有限公司；API staph試劑盒、葡萄球菌試劑盒，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

主要培養(yǎng)基：7.5%氯化鈉肉湯、S.aureus顯色培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

主要儀器：APILAB Plus系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃）；生化培養(yǎng)箱（購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2方法

1.2.1生牛乳在S.aureus測(cè)試片上初步篩選無菌操作取25mL生牛乳于225mL滅菌生理鹽水中，混勻；取1mL均勻放于S.aureus測(cè)試片中進(jìn)行初篩，37℃培養(yǎng)24h，有藍(lán)色菌落生長(zhǎng)為可疑陽性，沒有藍(lán)色菌落生長(zhǎng)為陰性。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

1.2.2菌株的分離純化及鑒定 取下有S.aureus可疑陽性菌落的測(cè)試片，置于無菌7.5%氯化鈉肉湯中，37℃培養(yǎng)24h。取一菌環(huán)肉湯劃線于金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，紫紅色為可疑菌落。挑取紫紅色可疑菌落，劃線于哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。從哥倫比亞血平板上取菌落做成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛鹊木鶆蚓鷳乙?，填充API試劑條中，37℃培養(yǎng)24h，加入APILAB Plus系統(tǒng)判讀。

1.2.3藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法，試驗(yàn)方法及結(jié)果判定按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2015年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1生牛乳在S.aureus測(cè)試片上初步篩選結(jié)果

陜西省西安市和渭南市20份生牛乳在S.aureus測(cè)試片上培養(yǎng)24h后發(fā)現(xiàn)，有3份樣品測(cè)試片出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，判斷為S.aureus陽性疑似菌落，菌落顏色明顯，界線清晰，與空白對(duì)照和陰性測(cè)試片差異明顯，篩查結(jié)果明顯且直觀，如圖1所示。

2.2菌株分離及生理生化鑒定

將3份有可疑菌落的測(cè)試片進(jìn)一步培養(yǎng)、分離、純化，最終通過APILAB Plus判定為：S.aureus 2株，鑒定結(jié)果分別為：SX1%ID=97.8%，T=1.00；SX2%ID=98.1%，T=0.9；木糖葡萄球菌（S.xylosus）1株；S.aureus的檢出率為10%。結(jié)果表明，取下陽性快檢測(cè)試片后，采用與國(guó)標(biāo)相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離、純化，結(jié)果可以很好地滿足生化鑒定的需要。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用目前國(guó)際通用的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2015年標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的微量肉湯稀釋法和結(jié)果判定方法，對(duì)分離得到的2株S.aureus進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表1。表明，在7種抗生素中，兩株S.aureus對(duì)青霉素及SX2對(duì)磺胺異惡唑表現(xiàn)為耐藥，其他則表現(xiàn)為敏感。

3討論與結(jié)論

生牛乳中S.aureus的篩選分離通常按照GB4789.10-2010的方法，先將所有樣品富集培養(yǎng)，再在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行分離鑒定，工作量大，消耗人力、物力多。何源等對(duì)重慶市生牛乳中S.aureus的污染狀況調(diào)查、薛秀恒等對(duì)安徽生牛乳中S.aureus的污染狀況調(diào)查均采用以上方法。本試驗(yàn)用S.aureus測(cè)試片進(jìn)行初篩，培養(yǎng)的樣品由20個(gè)減少到3個(gè)，減少了后續(xù)培養(yǎng)的數(shù)量；操作方法只是將1mL稀釋10倍的樣品加到測(cè)試片上培養(yǎng)即可，操作非常簡(jiǎn)便。該測(cè)試片對(duì)S.aureus的識(shí)別率為100%，對(duì)非葡萄球菌屬的抗干擾能力良好。對(duì)葡萄球菌屬的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，測(cè)試片對(duì)木糖葡萄球菌的抑制率約為80%。所以測(cè)試片上顯色的菌落仍需后續(xù)鑒定（以上數(shù)據(jù)由北京良潤(rùn)生物科技有限公司提供）。在本試驗(yàn)中經(jīng)過測(cè)試片初篩后得到的3個(gè)可疑菌株最后有一株鑒定為木糖葡萄球菌，與北京良潤(rùn)生物科技有限公司提供的數(shù)據(jù)吻合。說明本測(cè)試片不會(huì)出現(xiàn)假陰性，但可能會(huì)有假陽性出現(xiàn)。因此，本測(cè)試片可用于大量生牛乳樣品的S.aureus的初篩工作，以減少工作量。

世界范圍內(nèi)，該菌在生牛乳中的檢出率有國(guó)家和地區(qū)的差異，檢出率在12%～79%不等，本試驗(yàn)中生牛乳中S.aureus的檢出率為10%，這與重慶市（24.67%）、安徽?。?6.7%）的研究結(jié)果差異較大，說明不同地區(qū)生牛乳中S.aureus污染狀況不同。林柏玲等研究發(fā)現(xiàn)，上海和天津兩個(gè)城市牛乳中S.aureus污染情況相差較大（上海為0，天津?yàn)?6.09%），可能由于上海屬于比較現(xiàn)代化的大都市，企業(yè)的生產(chǎn)管理制度均比較嚴(yán)格，牧場(chǎng)的生產(chǎn)條件和周邊環(huán)境的要求較天津市高。這也說明只要對(duì)生產(chǎn)過程中每個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控，生牛乳的質(zhì)量是可以得到保證的。

本試驗(yàn)中兩株S.aureus對(duì)青霉素都為耐藥，對(duì)復(fù)方新諾明、紅霉素、萬古霉素、氧氟沙星、克林霉素都為敏感，可能因?yàn)樵谀膛?chǎng)的養(yǎng)殖過程中青霉素長(zhǎng)期單一使用。分離于不同奶牛場(chǎng)的S.aureus對(duì)所選7種抗生素的耐藥性也不同，這與趙修龍等的研究結(jié)果一致，這主要與不同牛場(chǎng)的管理和預(yù)防性用藥有關(guān)。本試驗(yàn)中復(fù)方新諾明、紅霉素、萬古霉素、氧氟沙星、克林霉素對(duì)兩株菌都有良好的抗菌作用，建議用于此地區(qū)奶牛隱性乳房炎的防治。建議奶牛場(chǎng)建立細(xì)菌藥敏動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)藥物敏感性，實(shí)時(shí)調(diào)整抗感染藥物的使用方案，有針對(duì)性地選用藥物，經(jīng)常更換抗生素種類。endprint