miRNA-30a在腎細胞癌中的表達及作用

秦丹丹 任野平

·臨床研究與應(yīng)用·

miRNA-30a在腎細胞癌中的表達及作用

秦丹丹 任野平

目的：探討微小RNA（miRNA）-30a在腎細胞癌組織和細胞中表達及其臨床意義。方法：收集95例2006年4月至2011年3月哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院收治患者，從獲取的新鮮腎細胞癌組織和對應(yīng)的正常對照組織樣本以及腎癌細胞系中分別提取總RNA，應(yīng)用熒光實時定量PCR（qRT-PCR）法檢測miRNA-30a表達水平，并分析miRNA-30a與臨床病理資料和預后的關(guān)系。采用生物信息學方法預測可能的靶基因并進行驗證。利用MTT法驗證miRNA-30a對細胞增殖的作用。結(jié)果：miRNA-30a在腎癌組織中表達水平顯著低于正常腎組織（P＜0.01），在腎癌細胞系中表達低于正常腎上皮細胞。miRNA-30a可抑制腎癌細胞的增殖。生物信息學方法和qRT-PCR表明，異黏蛋白（MTDH）為miRNA-30a靶基因。Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-30a高表達的腎癌患者總生存期優(yōu)于低表達者（P＜0.01）。結(jié)論：miRNA-30a在腎癌中低表達，miRNA-30a低表達與腎癌不良預后有關(guān)，并且miRNA-30a可通過MTDH抑制腎癌細胞的增殖。

腎細胞癌 miRNA-30a 增殖 預后 異黏蛋白

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是腎臟常見的一種惡性腫瘤，占全身腫瘤3%，且近20年腎細胞癌的發(fā)病率有所升高［1］。腎癌主要治療方法為手術(shù)，但約30%患者術(shù)后3年內(nèi)腫瘤復發(fā)，其5年生存率低于10%，另外約25%患者確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移［2］。因此，尋找一種可靠的生物學標記物，能對腎細胞癌進行早期診斷并能判斷患者預后以及指導個體化治療具有重要的意義。miRNA可通過影響腫瘤的增殖、遷移、侵襲等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的作用。microRNA（miRNA）是一種長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，主要功能是負性

調(diào)節(jié)靶基因表達。自1993年以來，迄今為止發(fā)現(xiàn)的miRNA已超過1 000種。成熟的miRNA可與相關(guān)蛋白結(jié)合形成RNA誘導復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC進一步與靶基因的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR3）結(jié)合，對mRNA的穩(wěn)定性或翻譯進行抑制。本研究檢測腎癌組織中miRNA-30a表達，分析其與臨床病理之間的關(guān)系，并初步檢測miRNA-30a對腎癌細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2006年4月至2011年3月哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院收治腎細胞癌患者95例，男性34例，女性61例，中位年齡60（38～84）歲，均接受手術(shù)治療。癌灶中央部位組織和作為對照的對應(yīng)癌旁正常組織均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前未行放化療或其他治療。切除標本后，立即將組織儲存于液氮中，存于-80℃，待用。腎透明細胞癌細胞株ACHN、Caki-1、Caki-2、786-0、A498、Ketr-3以及正常人腎臟細胞HK-2均購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。細胞使用含1%鏈霉素-氨芐青霉素、10%胎牛血清的DMEM，并在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。RNA提取試劑盒購自美國Thermo公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量PCR（qRT-PCR）試劑盒均購自德國QIAGEN公司。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Caki-1和Caki-2細胞轉(zhuǎn)染 miRNA-30a類似物/類似物對照物（NC）和miRNA-30a抑制劑/抑制劑對照物購自上海吉瑪公司。根據(jù)Lipofectamine 2000使用說明，對細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后提取細胞RNA核蛋白以行qRT-PCR和Western blot。

1.2.2 RNA提取和qRT-PCR檢測 按照試劑使用說明，使用Trizol提取細胞或組織總RNA。使用U6作為miRNA定量的內(nèi)參。采用SYBR Green PCR Master Mix進行qRT-PCR，對RNA進行定量。β-actin作為mRNA定量的內(nèi)參。所用引物如下：miRNA-30a上游引物為5'-GCCTGTAAACATCCTCGACTGGAAG-3'，下游引物為5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；異黏蛋白（metadherin，MTDH）上游引物為5'-ATCACAGTTA CCACCGAGCA-3'，下游引物為5'-CTTCTCCTCACC TGCACTGA-3'。miRNA表達水平以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt= ΔCt實驗組-ΔCt對照組，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖能力 對細胞進行miR?NA-30a類似物和抑制劑轉(zhuǎn)染，24 h后將細胞消化后行細胞計數(shù)。96孔板鋪板細胞密度為7.5×103/mL，每組6個復孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)檢測4天。從鋪板后第2天開始，加入10 μL/孔MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入150 μL/孔二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng)。檢測490 nm處吸光值。

1.2.4 生物信息學方法預測靶基因 使用miRNABase，TargetScan，PicTar和miRNAanda方法預測miRNA-30a可能的靶基因與結(jié)合位點。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。采用非參數(shù)秩和檢驗分析組織中miRNA-30a表達差異。采用χ2檢驗分析miRNA-30a表達水平與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系，Kaplan-Meier和Log rank方法分析miRNA-30a表達與患者生存率關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-30a在癌組織和腎癌細胞系中表達

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，miRNA-30a在大部分腎癌組織中表達顯著降低（圖1A），miRNA-30a表達在腎癌細胞系中低于非癌細胞系，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（圖1B）。

2.2 miRNA-30a與臨床病理指標的關(guān)系

為明確miRNA-30a在腎癌中的作用，進行miRNA-30a表達水平與臨床病理參數(shù)之間的分析。結(jié)果顯示，miRNA-30a表達水平與患者性別、腫瘤分化水平、腫瘤大?。ㄒ阅[瘤長徑與短徑乘積表示大小、選取中位數(shù)為界值分組）以及病理類型無明顯相關(guān)性（P＞0.05），miRNA-30a與腫瘤的分期呈負相關(guān)。表明miRNA-30a可能具有抑制腎癌的作用（表1）。

2.3 miRNA-30a表達與患者總生存期的關(guān)系

腎癌患者miRNA-30a表達水平以ΔΔCt=0.70為界分為高表達和低表達。Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-30a高表達患者預后明顯較好，高、低表達的中位生存期分別為41（12～60）、52（15～60）個月（P=0.006，圖2）。

圖1 miRNA-30a在癌組織和腎癌細胞系中的表達Figure 1 miRNA-30aexpressioninrenalcancertissuesandcelllines

表1 miRNA-30a與95例患者臨床病理的關(guān)系Table 1 Correlation between the clinicopathological characteristics and miRNA-30aexpressionin 95patients

2.4 miRNA-30a對腎癌細胞增殖的作用

分別對miRNA-30a低表達的Caki-1細胞、高表達的Caki-2細胞轉(zhuǎn)染miRNA-30a類似物/類似物對照物或miRNA-30a抑制劑/抑制劑對照物24 h后，行miRNA-30a表達定量分析（圖3A）。使用MTT法檢測miRNA-30a對細胞增殖的作用，結(jié)果表明miRNA-30a過表達可抑制細胞的增殖，抑制miRNA-30a后可促進細胞的增殖（圖3B，3C）。

2.5 MTDH與miRNA-30a靶向關(guān)系

使用生物信息學軟件預測miRNA-30a可能的靶基因，對預測的結(jié)果進行篩選，得到與腫瘤關(guān)系較密切的靶基因，本研究選定MTDH作為研究對象。MTDH與miRNA-30a結(jié)合位點具有物種保守性（圖4A斜體部分）。在腎癌細胞中轉(zhuǎn)染miRNA-30a類似物后，MTDH表達被抑制，而轉(zhuǎn)染miRNA-30a抑制劑后MTDH表達上調(diào)（圖4B），MTDH與miRNA-30a具有靶向關(guān)系。

圖2 miRNA-30a與腎癌患者預后Figure 2 miRNA-30aexpressionandprognosisinrenalcancerpatients

圖3 miRNA-30a對腎癌細胞增殖的作用Figure 3 EffectofmiR-30aonrenalcancercellproliferation

Hsa 5'AUGGUUUAGUUUACAAUUUUUAAAAAG 3'

Mml 5'AUGGUUUAGUUUACAAUUUUUAAAAAG 3'

Rno 5'UUGGUUUAGUUUACAGUUCUUUAAAAG 3'

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圖4 MTDH與miRNA-30a靶向關(guān)系Figure 4 Relationship between the MTDH and the miRNA-30a target gene

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在惡性腫瘤中表達異常，表明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用［3］。研究表明，miRNA-30a在乳腺、肝臟、肺臟、消化系統(tǒng)多種腫瘤中都起著重要作用［4-7］。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a在腎癌組織和細胞中低表達，腎癌的分期與表達呈負相關(guān)，miRNA-30a高表達的腎癌患者的預后優(yōu)于低表達者。腫瘤的分化程度雖與病理類型以及腫瘤的惡性程度相關(guān)，但本研究中miRNA-30a與腫瘤的分化程度和病理類型無明顯相關(guān)性，這可能與miRNA的組織特異性相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中常常發(fā)生染色體的失衡，包括染色體擴增、缺失或表觀遺傳學的變化。miRNA-30a位于染色體6q13，有研究表明在某些癌癥中由于雜合性丟失會導致其成為基因組脆性區(qū)域［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a在腎癌中表達下降，與上述的研究結(jié)果一致。

在多種腫瘤中進行了miR-30家族成員研究，雖然miR-30家族5個成員之間序列高度相同，但行使的功能卻有差別。有研究表明，在黑色素瘤中miRNA-30b/d可增強腫瘤的侵襲能力，從而發(fā)揮癌基因的作用［9］。miR-30e與miR-30b/d的種子序列雖相同，但與之相反的是在乳腺癌中miR-30e可發(fā)揮抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的作用［10］。Baraniskin等［11］研究表明，miRNA-30a可通過靶向DTL（denticleless protein homolog）抑制結(jié)腸癌的增殖。這些研究表明，miRNA功能的行使可能與其靶標有關(guān)，而且在不同類型的組織和細胞中，miRNA行使的功能也不同。

MTDH在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。MTDH基因位于染色體8q22上，在乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細胞瘤和星形膠質(zhì)細胞瘤等多種腫瘤中高表達并且與不良預后相關(guān)［12］。MTDH介導了多種形式的化療抵抗，有研究表明下調(diào)MTDH表達可增加腫瘤細胞對順鉑、多柔比星等藥物介導的細胞死亡［13］。MTDH可增強腫瘤細胞的侵襲性，通過NF-κB途徑增加相關(guān)黏附分子的表達，MTDH是Ha-ras下游基因，Ha-ras通過P13K/AKT/GSK3B/c-Myc途徑誘導MTDH大量表達［14］。尚有實驗表明，在乳腺癌中miRNA-30a可通過MTDH實現(xiàn)對腫瘤細胞的抑制作用［15］。本研究表明miRNA-30a對腫瘤細胞生物學行為的抑制作用可能是通過靶向MTDH實現(xiàn)的。

總之，本研究結(jié)果初步表明miRNA-30a可抑制腎癌的增殖，并且可改善腎癌患者的預后，應(yīng)在轉(zhuǎn)移和侵襲方面繼續(xù)探討miRNA-30a的作用。另外，基于miRNA家族成員之間發(fā)揮功能不同的特點，有必要研究miRNA家族所有成員在腎癌中的作用。在不久的將來miRNA-30a可能作為潛在的治療靶點。

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（2015-02-05收稿）

（2015-06-23修回）

秦丹丹 專業(yè)方向為狼瘡腎，腎腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：qindandan1989@126.com

IARC發(fā)布乳腺癌篩查指南

2014年11月，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（WHO/IARC）在法國里昂召集了16個國家的25位專家，對現(xiàn)有的乳腺癌篩查技術(shù)與方案的優(yōu)劣進行評估，重新制定乳腺癌篩查手冊，為世界各國開展乳腺癌篩查提供指導性意見，所形成的共識于6月3日在線發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學雜志》（N Engl J Med）。中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院喬友林教授、《中國腫瘤臨床》編委是唯一參加該篩查手冊制定的中國專家。

指導意見進一步肯定了鉬靶作為乳腺癌篩查方法的有效性，大量數(shù)據(jù)表明鉬靶篩查可明顯降低50～69歲女性死亡率，對于70～74歲女性的死亡率也有顯著降低，但是對于40～49歲女性，現(xiàn)存證據(jù)有限。該報告同時指出篩查帶來的風險如過度診斷、短期負面心理影響和檢查所產(chǎn)生的射線對乳腺癌發(fā)病率的影響，但考慮到篩查收益顯著大于射線產(chǎn)生的危害，IARC強烈建議對50～69歲女性開展有組織的定期鉬靶篩查，但現(xiàn)有證據(jù)仍無法確定最佳篩查間隔。

其他影像學方法及乳腺臨床檢查和自檢的評估指導意見指出，超聲作為鉬靶的輔助篩查技術(shù)在致密性乳房的女性中可提高鉬靶陰性結(jié)果中的乳腺癌檢出率，但也增加假陽性概率。值得注意的是，目前基于超聲的研究全部來自于觀察性研究，尚無高質(zhì)量、設(shè)計嚴謹?shù)那罢靶耘R床隨機對照試驗，無法評估其是否可降低人群乳腺癌死亡率。與超聲相似，臨床手診也缺少前瞻性臨床隨機對照試驗，難以評估其對死亡率的影響?，F(xiàn)有證據(jù)僅表明，相比未篩查組，臨床手診組檢出的乳腺癌病灶更小，腫瘤分期更早。對于其他影像學檢測技術(shù)，現(xiàn)有數(shù)據(jù)僅發(fā)現(xiàn)斷層成像技術(shù)輔助鉬靶篩查可顯著提高原位癌和浸潤性乳腺癌檢出率，但對人群死亡率的影響證據(jù)尚不充分。高危人群中多種篩查技術(shù)聯(lián)合方案，如核磁共振輔助鉬靶/超聲等有效性尚待研究證實。

——引自“醫(yī)學論壇網(wǎng)”網(wǎng)站

miRNA-30a expression in renal cell carcinoma and its effect on renal cancer cells

Dandan QIN,Yeping REN
Department of Nephrology,The 2ndAffiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China.

Yeping REN;E-mail:renyeping0123@126.com

Objective:To investigate the expression and clinical significance of microRNA-30a in renal cell carcinoma(RCC). Methods:The miRNA-30a expression in renal tissues and cell lines was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR),and the relationship between miRNA-30a expression and the clinicopathological features of RCC was analyzed.The effect of miRNA-30a on cancer cells was evaluated using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay.In addition,a bioinformatics algorithm was adopted to predict the potential targets of miRNA-30a.Results:miRNA-30a was downregulated both in RCC tissues and cell lines.Patients with higher miRNA-30a expression exhibited better prognosis than those with lower miRNA-30a expression.Bioinformatics algorithm and qRT-PCR both indicated that metadherin(MTDH)was a target of miRNA-30a.Moreover,MTT results showed that miRNA-30a could inhibit cell proliferation.Conclusion:miRNA-30a was inhibited in renal cancer,and low miRNA-30a expression was associated with poor prognosis.In addition,miRNA-30a could inhibit the growth of cells through MTDH.

renal cell cancer,miRNA-30a,proliferation,prognosis,MTDH

10.3969/j.issn.1000-8179.20150182

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)一科（哈爾濱市150086）

任野平 renyeping0123@126.com