全自動(dòng)高通量與半自動(dòng)ELISA檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物臨床應(yīng)用比較

沈 菁，徐如梅，范雪嬌，陳 雯，伍嚴(yán)安

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州350001)

全自動(dòng)高通量與半自動(dòng)ELISA檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物臨床應(yīng)用比較

沈 菁，徐如梅，范雪嬌，陳 雯，伍嚴(yán)安

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州350001)

目的比較全自動(dòng)高通量ELISA(全自動(dòng)法)和半自動(dòng)ELISA檢測(cè)系統(tǒng)（半自動(dòng)法）對(duì)HBV血清標(biāo)志物結(jié)果的差異，探討全自動(dòng)ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法對(duì)自2011年6月至2013年4月用半自動(dòng)和2013年6月至2015年4月用全自動(dòng)法檢測(cè)HBV 5項(xiàng)血清標(biāo)志物的數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性研究。統(tǒng)計(jì)日常應(yīng)用室內(nèi)定值弱陽(yáng)性質(zhì)控S/CO值的CV值、失控率、失控原因以及臨床標(biāo)本的復(fù)檢率、復(fù)檢樣本的符合率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果全自動(dòng)法檢測(cè)HBV 5項(xiàng)血清標(biāo)志物室內(nèi)質(zhì)控S/CO值的CV值（24.66%、25.44%、23.8%、49.64%、70.14%）均小于半自動(dòng)法（27.67%、34.32%、29.21%、54.88%、90. 6%）。失控率（0.99%、1.66%、1.32%、0.66%、0.5%）均小于半自動(dòng)法（1.5%、1.82%、1.66%、1.0%、0.67%），但無(wú)明顯差異（P＞0. 05）。日常標(biāo)本的復(fù)檢率（1.62%）明顯小于半自動(dòng)法（3.55%）（P＜0.01）。復(fù)檢樣本的符合率（55.37%）明顯大于半自動(dòng)法（42. 11%）（P＜0.01），特別是HBV血清標(biāo)志物少見(jiàn)模式和HBsAg弱陽(yáng)性樣本的檢測(cè)。結(jié)論全自動(dòng)法檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物的穩(wěn)定性、重復(fù)性以及準(zhǔn)確性均優(yōu)于半自動(dòng)法。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；全自動(dòng)法；半自動(dòng)法；乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒(HBV，乙肝)感染是世界性公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)之一，被認(rèn)為是病毒性肝炎最重要的一個(gè)原因[1]。根據(jù)WHO數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上共有20億人口曾感染HBV，我國(guó)感染HBV人數(shù)占全球感染人數(shù)的33%[2]。現(xiàn)階段，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物的方法有多種，ELISA是臨床應(yīng)用最早且目前仍廣泛使用的半定量檢測(cè)方法，其靈敏度、準(zhǔn)確性與重復(fù)性雖不及電化學(xué)發(fā)光免疫分析與時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)[3]，但其具有檢測(cè)成本低廉，成批檢測(cè)時(shí)間消耗不長(zhǎng)，設(shè)備儀器要求不高等優(yōu)點(diǎn)。目前用ELISA方法檢測(cè)乙型肝炎病毒5項(xiàng)血清標(biāo)志物HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc (HBV-M）仍廣泛應(yīng)用于各個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室。由于實(shí)驗(yàn)室條件不同，在操作上有手工、半自動(dòng)和全自動(dòng)等不同方法。這三種方法之間檢測(cè)結(jié)果的差別以及對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響值得研究，但相關(guān)報(bào)道較少。

本文對(duì)通過(guò)對(duì)本院2013年6月至2015年4月用全自動(dòng)高通量ELISA法（全自動(dòng)法）和2011年6月至2013年4月用半自動(dòng)ELISA法（半自動(dòng)法）檢測(cè)HBV-M日常室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)以及臨床標(biāo)本檢測(cè)的復(fù)檢情況進(jìn)行回顧性分析，比較在長(zhǎng)期臨床檢測(cè)中，全自動(dòng)法與半自動(dòng)法檢測(cè)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源本院ELISA法檢測(cè)HBV-M自2011年6月至2013年4月期間用半自動(dòng)法的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)以及臨床樣本44984例；2013年6月至2015年4月期間用全自動(dòng)法的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)以及臨床樣本48694例。

1.2 儀器與試劑全自動(dòng)法：煙臺(tái)艾德康生物科技有限公司產(chǎn)的Addcare ELISA 600高通量ELISA檢測(cè)系統(tǒng)；半自動(dòng)法：瑞士帝肯公司產(chǎn)的TECAN freedom EVO前處理系統(tǒng)和TECAN Sunrise酶標(biāo)儀；PW-960多功能酶標(biāo)洗板機(jī)；HH-W-600數(shù)顯電熱恒溫水箱。試劑均采用英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒；室內(nèi)質(zhì)控品采用北京康徹斯坦生物科技有限公司生產(chǎn)的定值弱陽(yáng)性質(zhì)控（HBsAg0.2IU/ml、HBsAb30mIU/ml、HBeAg 2NCU/ml、HBeAb 4NCU/ml、HBcAb 4NCU/ml）。

1.3 方法⑴根據(jù)兩檢測(cè)系統(tǒng)在兩期間內(nèi)HBV-M每項(xiàng)目每日應(yīng)用室內(nèi)定值弱陽(yáng)性質(zhì)控的S/CO值計(jì)算其CV值；按本室SOP文件設(shè)12S、13S和1cutoff(+)為弱陽(yáng)性質(zhì)控品的質(zhì)控規(guī)則（12S表示弱陽(yáng)性質(zhì)控的S/CO值超過(guò)x±2s判為警告，13S表示超過(guò)x±3s判為失控，1cutoff(+)表示弱陽(yáng)性質(zhì)控的S/CO值小于1為失控），設(shè)1cutoff(-)為陰性質(zhì)控品的質(zhì)控規(guī)則（1cutoff(-)表示陰性質(zhì)控的S/CO值大于或等于1為失控），最后根據(jù)室內(nèi)失控報(bào)告記錄計(jì)算失控率并以失控原因進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。⑵為了便于表述，對(duì)HBV-M血清學(xué)陽(yáng)性標(biāo)志，按順序編號(hào)：①HBsAg、②抗-HBs、③HBeAg、④抗-HBe、⑤抗-HBc。例如“135”表示：HBsAg陽(yáng)性，抗-HBs陰性、HBeAg陽(yáng)性、抗-HBe陰性、抗-HBc陽(yáng)性，余類推。統(tǒng)計(jì)兩期間內(nèi)兩檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)HBV-M臨床標(biāo)本的復(fù)檢率，并根據(jù)HBV-M血清學(xué)模式將需復(fù)檢的標(biāo)本進(jìn)行分組，按初檢和最終報(bào)告結(jié)果一致的為符合，計(jì)算每組中需復(fù)檢標(biāo)本的符合率。最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全自動(dòng)法與半自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M室內(nèi)定值弱陽(yáng)性質(zhì)控的S/CO值的CV值比較根據(jù)2013年6月至2015年4月用全自動(dòng)法和2011年6月至2013年4月用半自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M每日室內(nèi)定值弱陽(yáng)性質(zhì)控的S/CO值，分別計(jì)算每項(xiàng)目的CV值，全自動(dòng)法均小于半自動(dòng)法。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 全自動(dòng)法與半自動(dòng)法室內(nèi)質(zhì)控CV值（%）

2.2 全自動(dòng)法與半自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M室內(nèi)質(zhì)控失控率的比較根據(jù)2013年6月至2015年4月用全自動(dòng)法和2011年6月至2013年4月用半自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M的室內(nèi)失控報(bào)告記錄，分別計(jì)算每項(xiàng)目的失控率，全自動(dòng)法均小于半自動(dòng)法，但無(wú)明顯差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。以失控原因分類，人為因素全自動(dòng)法占28.6%(8/28)，半自動(dòng)法占60%（24/ 40）；儀器因素全自動(dòng)法占50%(14/28)，半自動(dòng)占32.5%（13/40）；試劑因素全自動(dòng)法占14.3%(4/28)，半自動(dòng)占7.5%（3/40）。其它原因各2次。

2.3 全自動(dòng)法與半自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M常規(guī)樣本中復(fù)檢樣本數(shù)據(jù)分析

2.3.1 樣本一般情況2011年6月至2013年4月半自動(dòng)法共檢測(cè)HBV-M44984例，復(fù)檢1596例；2013年6月至2015年4月全自動(dòng)法共檢測(cè)48694例，復(fù)檢873例。根據(jù)初檢HBV-M模式將需復(fù)檢標(biāo)本分四組，將模式“15”“145”中HBsAg S/CO值1～3為A組；“15”“145”中HBsAg S/CO值3～5為B組；“15”“145”中HBsAg S/CO值5～10為C組；“1”“12”“1245”“23”“2345”“124”“125”“1235”“14”這些少見(jiàn)模式為D組。具體分布情況如表2所示。

2.3.2 兩檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)檢樣本的符合率比較從表2看出全自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M總的復(fù)檢率(1.62%)明顯低于半自動(dòng)法(3.55%），二者差異有顯著性（P＜0.01）。且兩檢測(cè)系統(tǒng)在每組復(fù)檢標(biāo)本的符合率上均有顯著性差異（P＜0.05），特別是在少見(jiàn)模式組和HBsAg弱陽(yáng)性樣本A和B組的差異更顯著（P＜0.01）。具體見(jiàn)表3。

3 討論

ELISA是實(shí)驗(yàn)室最為常用的免疫測(cè)定技術(shù)之一，廣泛用于臨床疾病血液及其它體液標(biāo)志物的檢測(cè)。通常是以微孔板條為固相的測(cè)定模式，以抗原抗體免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的測(cè)定方法，一般涉及標(biāo)本的前處理、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色以及結(jié)果的判斷和解釋等方面。其中任一步驟的不規(guī)范都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚[4，5]。目前各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)自動(dòng)化水平不一，在ELISA標(biāo)準(zhǔn)化方面做的不足，這導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陰性與假陽(yáng)性數(shù)量增多，影響檢測(cè)結(jié)果[6]。本文通過(guò)回顧性分析比較本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)全自動(dòng)高通量后和先前半自動(dòng)ELISA檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)HBV-M檢測(cè)結(jié)果的差異，探討全自動(dòng)ELISA檢測(cè)系統(tǒng)在常規(guī)HBV-M樣本檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

表1 全自動(dòng)法與半自動(dòng)法室內(nèi)質(zhì)控失控率的比較（%）

表2 兩檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)檢樣本分布率（%）

表3 兩檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)檢樣本的符合率比較（%）

本研究從近兩年的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分析顯示，全自動(dòng)法檢測(cè)HBV-M，每項(xiàng)目弱陽(yáng)性質(zhì)控品的批間CV值和失控率均小于半自動(dòng)法；從失控原因分類上看，全自動(dòng)法因人為因素造成的失控（28.6%）明顯少于半自動(dòng)法（60%）。在人為因素中，全自動(dòng)法檢測(cè)主要是實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備不足造成（試劑準(zhǔn)備、洗液配制、質(zhì)控品的使用等情況），半自動(dòng)法檢測(cè)除了上述因素還增加了溫育溫度和時(shí)間的控制、洗板的方式等主要原因。這表明全自動(dòng)法嚴(yán)格控制加樣、溫育、洗板、結(jié)果判讀等過(guò)程，同項(xiàng)測(cè)定的每一次實(shí)驗(yàn)條件幾乎一致，確保了操作的穩(wěn)定性，避免了人為誤差，提高了檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。同時(shí)我們應(yīng)該看到，兩檢測(cè)系統(tǒng)因儀器因素造成失控比例不少，特別是全自動(dòng)占了50%，這表明儀器的正確使用、定期的維護(hù)和校準(zhǔn)，是進(jìn)一步保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定的重要因素。

由于HBV的固有流行病學(xué)特征，使其血清學(xué)標(biāo)志物檢出模式復(fù)雜化，再者ELISA法檢測(cè)HBVM影響因素較多，常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，已有相關(guān)HBV-M少見(jiàn)模式分析的研究報(bào)道[7，8]。本文對(duì)近四年常規(guī)檢測(cè)HBV-M臨床樣本的復(fù)檢情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，應(yīng)用全自動(dòng)法后對(duì)少見(jiàn)模式樣本的復(fù)檢率明顯降低（P＜0.01），且復(fù)檢正確率明顯高于半自動(dòng)法（P＜0.01）。另一方面，有作者認(rèn)為，對(duì)臨床標(biāo)本HBsAg的檢測(cè)結(jié)果，首次定性陰性的基本可以認(rèn)為是真陰性，而陽(yáng)性反應(yīng)者不一定為真陽(yáng)性[9]。HBsAg的定性結(jié)果對(duì)于乙肝的診斷和治療非常重要[10]，因此臨床檢測(cè)HBsAg為弱陽(yáng)性時(shí)，要復(fù)檢以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文進(jìn)一步將復(fù)檢標(biāo)本“145”(小三陽(yáng))和“15”陽(yáng)性的標(biāo)本按HBsAg的S/CO值分三組（1～3、3～5、5～10），每組在應(yīng)用全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)后的復(fù)檢率均明顯降低（P＜0.01），且復(fù)檢符合率均明顯高于半自動(dòng)法（P＜0.05），特別是HBsAg弱陽(yáng)性樣本（S/CO值1～5）的復(fù)檢符合率顯著高于半自動(dòng)法（P＜0.01）。這表明應(yīng)用全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)成本。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室ELISA檢測(cè)HBV-M近四年數(shù)據(jù)的回顧性分析結(jié)果，提示全自動(dòng)高通量ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、重復(fù)性以及準(zhǔn)確性均優(yōu)于半自動(dòng)法，有利于HBV-M ELISA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，提高該項(xiàng)目的檢測(cè)質(zhì)量，值得在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

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Clinical application comparison of full-automatic and semi-automatic ELISA methods for detecting HBV serologic markers

SHEN Jing，XU Rumei，F(xiàn)AN Xuejiao，et al.
Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，Provincial Clinical College of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China.

Objective To investigate the clinical value of automatic ELISA system in detecting HBV serologic markers-HB-sAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，and HBcAb(HBV M)，to determine the deference between full-automatic ELISA methods(automatic method)and semi-automatic ELISA methods(semi-automatic method).Methods A retrospective study was made.The data of HBV M test using semi-automatic method from June 2011 to April 2013 and automatic method from June 2013 to April 2015 were collected.CV of S/CO of internal quality control with a weak positive value，rate of out-of-control，cause of out-of-control，retest rate and accuracy of retest samples in routine laboratory work were calculated for statistical analysis.Results Of the automatic method，the CVs in internal quality control of HBV M（24.66%，25.44%，23.8%，49.64%and 70.14%）were lower than that of semi-automatic method（27.67%，34.32%，29.21%，54.88%and 90.6%）respectively，and the rate of out-of-control（0.99%，1. 66%，1.32%，0.66%and 0.5%）were also lower than that of semi-automatic method（1.5%，1.82%，1.66%，1.0%and 0.67%）respectively，but without statistically significance(P＞0.05).Similarly the retest rate from automatic method for routine samples（1. 62%）were lower than that in semi-automatic method significantly（3.55%）（P＜0.01)，and the accuracy of retest samples（55.37%）in ordinary laboratory work was higher than that in semi-automatic method（42.11%）（P＜0.01），especially in rare pattern of HBV M and samples with weakly positive HBsAg.Conclusion The stability，repeatability and accuracy of the automatic ELISA method were superior to that of semi-automatic method in detection of serum HBV markers.

ELISA；automation method；semi-automation method；HBV

R446.61，R512.6+2

A

1674-1129(2015)06-0701-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.003

2015-09-09；

2015-10-16)

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心，課題編號(hào)：28-1-2作者簡(jiǎn)介：沈菁，女，1973年5月生，副主任技師，主要從事臨床免疫工作

伍嚴(yán)安，女，1954年5月生，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫分子診斷的相關(guān)性研究