海南五指山小葉榕樹須中總黃酮含量測定

(瓊州學院 理工學院，海南 三亞572022)

0 前言

小葉榕樹(Ficus concinna)，屬?？瞥＞G小喬木，生長于海南省村邊或山林中.海南五指山黎族民間早有小葉榕樹的藥用記載，用其浸膏作為治哮喘和支氣管炎咳嗽的主要成分，用其樹須作為治療骨傷，骨折的主要成分等［1］.

小葉榕樹須用作藥物主要是其含有黃酮類化合物.黃酮是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，作為抗氧化劑和自由基清除劑，具有抗炎鎮(zhèn)痛、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗衰老等作用［2］.

從植物中提取黃酮類化合物的常見方法主要有冷浸法、熱浸法、回流提取法和微波法等.夏開元和代現(xiàn)平分別從銀杏葉和藍靛果忍冬種提取總黃酮［3－4］.羅偉強用水提取法、70%乙醇提取法、95%乙醇提取法、丙酮提取法四種方法提取柑皮中的黃酮，經(jīng)比較得出70%乙醇提取法總黃酮的提取率最高［5］.

本文以小葉榕樹須為原料，選擇溶解性能好、無毒、對天然藥材細胞具有穿透能力的乙醇作為提取溶劑，用蘆丁標準曲線法測定總黃酮含量，以乙醇濃度，浸提溫度和浸提時間為實驗變量，研究小葉榕樹須中總黃酮的最佳提取工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然干燥的小葉榕樹須，采自海南五指山市南圣河岸邊.

無水乙醇(AR);95%乙醇(AR);蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所).

1.2 儀器

UV－2550 紫外分光光度計(日本島津公司);離心機;電子天平(I 級，奧豪斯儀器上海有限公司制造);高速萬能粉碎機(六兩裝，QE－300 克，浙江屹立工貿(mào)有限公司).

1.3 實驗步驟

將若干自然晾干的小葉榕樹須置于萬能粉碎機中粉碎至60－80 目，稱取5.00 g 粉碎樣品，用75 ml乙醇溶液浸泡3 d，將浸泡液用抽濾器過濾，除去不溶物，再用30 ml 石油醚萃取(用來去除原料中蠟質(zhì)層中的胡蘿卜素、葉綠素、油脂等各類脂溶性色素)，留下層清液備用。用移液管取清液1.00 ml 于25 ml 具塞試管中，加入0.50 mol/L NaNO2溶液1.00 ml，振蕩搖勻，5 分鐘后，加入0.30 mol/L AlCl3溶液1.00 ml，搖勻，加入1.00 mol/L NaOH 溶液5.00 ml ，最后用60%乙醇溶液定容至刻度，用紫外可見分光光度計測量504 nm 的吸光度.

1.3.1 確定最佳乙醇濃度

室溫下，分別測定乙醇溶液體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%、95% 和100%時浸提液的吸光度，計算相應(yīng)的提取率，確定提取總黃酮的最佳乙醇濃度.

1.3.2 確定最佳提取溫度

用75ml 60% 乙醇溶液浸提樣品，分別測定溫度為40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃時浸提液對應(yīng)的吸光度，計算相應(yīng)的提取率，從而得出最佳的提取溫度.

1.3.3 確定最佳浸泡時間

在60%乙醇溶液、溫度為60℃的的條件下熱浸小葉榕樹須樣品，分別浸泡4、5、6、7、8、9、10 小時，測定對應(yīng)的吸光度，計算不同浸泡時間的提取率，從而得出最佳的提取時間.

2 結(jié)果與分析

2.1 定性實驗結(jié)果

2.1.1 紫外光譜測定黃酮化合物

將室溫下40%乙醇浸提所得的清液0.1 ml 稀釋到25 ml，在紫外分光光度計下進行光譜掃描，掃描的波長范圍為200 nm－700 nm，光譜掃描結(jié)果如圖1、表1所示.

圖1 黃酮提取液原液光譜掃描譜圖

表1 黃酮提取液原液光譜掃描對應(yīng)吸光度

黃酮類化合物在紫外分光光度計檢測時，具有本身特定的紫外吸收譜帶.其中，其結(jié)構(gòu)中的肉桂酰環(huán)產(chǎn)生的帶在300－400 nm 范圍內(nèi)，由苯甲酰環(huán)產(chǎn)生的帶在220－280 nm 左右［6］.本實驗的提取物在372 nm和252 nm 處存在吸收峰，故證明了黃酮的存在.

2.1.2 化學方法鑒定黃酮化合物存在

用提取液與三氯化鋁的反應(yīng).用膠頭滴管將黃酮提取液樣品滴在濾紙上，再滴上質(zhì)量分數(shù)為1% 的三氯化鋁乙醇溶液，干燥.在可見光下濾紙為淡黃色，在紫外光下有顯著的黃色熒光點跡，證明有黃酮的存在.

2.2 黃酮處理液最大吸收波長的選擇

由于蘆丁標準液最大特征吸收峰在504 nm 處，紫外吸收光譜圖2［7］，小葉榕樹須黃酮提取物顯色后掃描曲線圖3和蘆丁標樣在504 nm 處吸收最大，且峰形相似對稱，故本研究選擇了504 nm 作為黃酮提取液的最佳測定波長.

圖2 蘆丁標準液紫外譜圖

圖3 黃酮提取液紫外光譜掃描譜圖

2.3 實驗數(shù)據(jù)記錄與分析

2.3.1 制備蘆丁對照品溶液

精密稱取蘆丁對照品0.0120 g，用體積分數(shù)為60% 乙醇溶液定容至250 ml ，制成48 ug/ml 貯備液備用.

2.3.2 繪制蘆丁標準曲線

分別精密移取蘆丁對照品儲備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 和7.0 ml 于25 ml 具塞試管中，先加入0.50 mol/L NaNO2溶液1.00 ml，搖勻，靜置5 分鐘后，再加入0.30 mol/L AlCl3溶液1.00 ml，搖勻，最后加入1.00 mol/L NaOH 溶液5.00 ml，再用體積分數(shù)為60%乙醇溶液定容至刻度線處，配制一系列蘆丁乙醇標準溶液.將一系列蘆丁乙醇標準溶液進行光譜掃描，比色皿取用的規(guī)格為1 cm，掃描的波長為504 nm，記錄相應(yīng)的吸光度，如表2所示.

表2 蘆丁濃度－吸光度關(guān)系

以吸光度值為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標作蘆丁標準曲線，得到回歸方程，可以看出線性比較好，可以用于研究總黃酮的線性標準.其中y=0.0116x－0.0042，R2=0.9994，蘆丁標準曲線及其回歸方程如圖4所示.

圖4 蘆丁標準曲線及其回歸方程

2.3.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

在室溫下，分別選用體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%、95%和100%的乙醇浸提樣品3d，其提取率結(jié)果見表3.

表3 不同乙醇濃度總黃酮提取率

由表3可知，室溫下，五指山小葉榕樹須粉未乙醇溶液浸提的最佳濃度為60%，總黃酮的提取率最高為0.061%.這和小葉榕樹須中總黃酮的溶解性能有關(guān).總黃酮既有一定的水溶性，又有一定的脂溶性.當乙醇濃度低于60%時，脂溶性是影響的主要因素;當乙醇濃度高于60%時，浸取液中水體積分數(shù)降低，抑制了總黃酮的水溶性，從而使提取率較低.

2.3.4 溫度對總黃酮提取率的影響

選取最佳浸提濃度60%作為乙醇溶液的固定浸提濃度，分別選用40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃的溫度熱浸8 h，研究溫度對小葉榕樹須總黃酮提取率的影響，結(jié)果見表4.

表4 不同溫度下總黃酮提取率

由表4可知，當浸提乙醇濃度為60%時，最佳浸提溫度為60 ℃，總黃酮的提取率最高為0.79%.這和乙醇的沸點有關(guān)，乙醇的沸點是78℃，超過60℃后體系中乙醇揮發(fā)速度加快，抑制了總黃酮的脂溶性，從而使提取率降低.

2.3.5 浸泡時間對總黃酮提取率的影響

選取最佳浸提乙醇濃度60%，最佳提取溫度60℃作為浸提條件，熱浸小葉榕樹須樣品，分別浸泡4、5、6、7、8、9 和10 小時，小葉榕樹須總黃酮提取率見表5.

表5 不同浸泡時間總黃酮提取率

由表5可知，當浸提乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃時，最佳浸提時間為8 小時，總黃酮提取率最高為0.79%.該浸提條件即為最佳浸提條件.3 結(jié)論

本文研究了乙醇濃度、浸提溫度和浸提時間對總黃酮提取率的影響，確定了海南五指山小葉榕樹須中總黃酮的最佳提取條件，分別為乙醇濃度60%(體積分數(shù))，溫度60℃，浸提時間8 h，總黃酮的提取率可達0.79%.

［1］黃鎖義，黎海妮，唐玉蓮，等.小葉榕榕樹須總黃酮提取及對羥自由基清除研究［J］.化工生產(chǎn)與技術(shù)，2006(4):16－18.

［2］張來，楊碧昌，劉寧.植物黃酮類化合物在醫(yī)藥上的應(yīng)用［J］.安順學院學報，2010，12(2):84－88.

［3］夏開元.二氧化碳超臨界流體萃取研究進展［J］.中成藥，1997，19(5):43.

［4］代現(xiàn)平.正交試驗優(yōu)化藍靛果忍冬中總黃酮的提取工藝［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(2):759－763.

［5］羅偉強.四種提取柑皮中黃酮化合物的方法比較［J］.甘肅化工，2003(1):25－46.

［6］崔鑰，王玉枝，歐陽湘元，等.微波輔助提?。梢姺止夤舛确y定穿心蓮中的總黃酮［J］.分析試驗室，2008，27(S2):26－29.

［7］王立升，劉力恒，黃仁彬，等.超聲波提取小葉榕葉總黃酮工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28 (12):91－95.