黑曲霉A.niger 6640生物轉(zhuǎn)化制備蔗果低聚糖*

劉冬梅 周勁松 尚雍賀 楊丹霞 柯亦純 于淑娟

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州510640)

蔗果低聚糖(FOS)是由1 ～3 個(gè)果糖基通過β-1，2 糖苷鍵與蔗糖(GF)中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)等的混合物［1-2］，是一種新型的功能性低聚糖.FOS 熱量低，具有降血脂、防齲齒、防止有害菌生長等優(yōu)異性能，還能促進(jìn)人體中益生菌(如雙歧桿菌)的生長，因此被廣泛應(yīng)用于食品、飼料和化妝品等行業(yè)［3-4］.目前生產(chǎn)FOS 的方法主要有5 種:(1)直接從天然植物原料中提取;(2)利用天然多糖的酶水解反應(yīng)獲得;(3)利用天然多糖的酸水解反應(yīng)獲得;(4)利用微生物發(fā)酵及其轉(zhuǎn)移酶、水解酶催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成［5-7］;(5)通過化學(xué)合成的方法獲得.其中利用微生物及其相應(yīng)的酶制備FOS 不僅能夠提高生產(chǎn)效率，還能夠降低生產(chǎn)成本，故而得到廣泛應(yīng)用，具有良好的發(fā)展前景.但目前報(bào)道的生產(chǎn)菌株產(chǎn)量不高，其中β-呋喃果糖苷轉(zhuǎn)移酶的酶活低且不穩(wěn)定［8-11］，因此篩選出高產(chǎn)和穩(wěn)定的菌株及其轉(zhuǎn)移酶，是目前該行業(yè)的重要研究內(nèi)容之一.筆者前期研究已篩選得到一株黑曲霉A.niger 6640，能耐受50 ～60 ℃的高溫，而且能耐受糖蜜中的無機(jī)鹽發(fā)酵產(chǎn)生高濃度FOS，但該菌株及β-呋喃果糖苷轉(zhuǎn)移酶(簡稱β-Ffase)的性質(zhì)尚未清晰.本研究首先利用高效液相色譜法檢測黑曲霉A.niger 6640 的發(fā)酵產(chǎn)物中FOS 的含量，并優(yōu)化其發(fā)酵條件;對A.niger 6640中β-Ffase 粗酶的性質(zhì)(pH 值、發(fā)酵時(shí)間、酶用量)等進(jìn)行研究，最后用陰離子柱DEAE Sepharose CL-6B 分離純化β-Ffase，利用SDS-PAGE 電泳初步鑒定β-Ffase 的分子質(zhì)量.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

黑曲霉A.niger 6640，由華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室篩選，于2012年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6640.

1.1.2 主要試劑

蔗糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸，分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn);蛋白胨、酵母浸膏，生物試劑，廣東環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn);玉米粉，食品級，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn);蔗果三糖(1-Kestose)、蔗果四糖(Nystose)、蔗果五糖(1F-Fructofuranosylnystose)，色譜純，日本和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn);果糖、葡萄糖、蔗糖，色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品.

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F 無菌工作臺、立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);PYX2190S2A 恒溫培養(yǎng)箱，科力電器公司生產(chǎn);pHS-3C 酸度計(jì)，上海精科儀器有限公司生產(chǎn);AG22331 型低溫高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司生產(chǎn);高效液相色譜儀系統(tǒng)，Waters 1525 Binary HPLC Pump 二元梯度泵，2487 Dual λ absorbance 雙波長檢測器，Waters 717 plus Autosampler 717+自動(dòng)進(jìn)樣器，沃特世科技(上海)有限公司提供;Rezex RCM-Monosaccharife Cat 7 mm×D300 mm，美國菲羅門公司生產(chǎn).

1.1.4 培養(yǎng)基及配方

培養(yǎng)基中各成分的含量以質(zhì)量濃度計(jì).

黑曲霉A.niger 6640 種子液培養(yǎng)基(簡稱BMC):蔗糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 3 g/L.

黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 用培養(yǎng)基(簡稱BMF):蔗糖400 g/L、K2HPO4·3H2O 11 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、酵母膏35 g/L、NaNO310 g/L.

黑曲霉A.niger 6640 產(chǎn)β-Ffase 的種子液培養(yǎng)基(簡稱BMCE):蔗糖20 g/L、玉米粉30 g/L、酵母浸膏75 g/L、NaNO32 g/L.

黑曲霉A.niger 6640 產(chǎn)β-Ffase 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(簡稱BMFE):蔗糖70g/L、玉米粉15g/L、酵母浸膏20 g/L、NaNO33 g/L.

緩沖液A 為磷酸氫二鈉- 檸檬酸緩沖液，將0.2 mol/L 磷酸氫二鈉和0.1 mol/L 檸檬酸溶液配制成不同pH 值的緩沖液;緩沖液B 為Tris-HCl 緩沖液.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FOS 含量的測定

采用高效液相色譜法檢測黑曲霉A.niger 6640的發(fā)酵產(chǎn)物中FOS 的含量.流動(dòng)相為雙蒸水，使用前經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，超聲脫氣，流動(dòng)相流速為0.6 mL/min，柱溫80℃;樣品溶液在8000r/min 下離心10 min 后取上清液，先稀釋12 倍，然后再用0.22 μm膜過濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為10 μL;共有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、葡萄糖、果糖、蔗糖6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成4 種不同質(zhì)量濃度的溶液，其中前5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度均相同，各為1.333、2.670、3.560、5.333 g/L;蔗糖溶液的質(zhì)量濃度分別為1.333、3.333、4.670、6.670 g/L.用Empower 積分軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.FOS 含量為蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖絕對含量的總和，單位為g/L.FOS 相對百分比為FOS 的面積占總面積百分比.

1.2.2 黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的條件優(yōu)化

將A.niger 6640 孢子接種于BMC 中，培養(yǎng)24 h(溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速125 r/min)后為種子液，以體積分?jǐn)?shù)10 %將種子液接種至BMF 中，用于條件優(yōu)化研究的基本條件為蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，調(diào)節(jié)pH 值為8.3，發(fā)酵48 h(溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速125 r/min)后為發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)滅菌后置于4 ℃?zhèn)溆?

將BMF 培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)pH 值為6.5、7.1、7.6、8.3、9.0，其他條件不變，研究pH 值對A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響.

其他條件不變，在發(fā)酵溫度分別為24、28、32、36、40 ℃條件下研究發(fā)酵溫度對A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響.

其他條件不變，在發(fā)酵時(shí)間分別為24、32、40、48、56 h 的條件下研究發(fā)酵時(shí)間對A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響.

其他條件不變，在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%的條件下研究蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響

1.2.3 黑曲霉A.niger 6640 中β-Ffase 的性質(zhì)初步研究

1.2.3.1 A.niger 6640 中β-Ffase 粗酶制備

制備工藝為種子液活化→酶的誘導(dǎo)→菌絲體分離→真空干燥或真空冷凍干燥→菌絲體破碎→β-Ffase 粗酶.具體為:在100mL 的BMCE 中接入1 環(huán)A.niger 6640 孢子，培養(yǎng)24h(溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速130 r/min)后為產(chǎn)酶種子液;于500mL 的錐形瓶中，將產(chǎn)酶種子液以體積分?jǐn)?shù)5%接種至200 mL BMFE 中，培養(yǎng)48 h(溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速130 r/min)后為誘導(dǎo)培養(yǎng)物;將誘導(dǎo)培養(yǎng)物經(jīng)滅菌400 目的濾袋過濾后，分別置于50℃、真空度為586.16 Pa 的真空干燥箱和-40 ℃、真空度為206.88 Pa 的真空冷凍干燥箱中干燥約24 h，干燥后水分含量低于5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，再經(jīng)破碎后為β-Ffase 粗酶粉.

1.2.3.2 A.niger 6640 的β-Ffase 反應(yīng)體系的制備

在50mL 的離心管中，將2g 蔗糖溶解于3mL 的緩沖液中，加入β-Ffase 粗酶粉0.004 g，攪拌均勻后在33 ℃、轉(zhuǎn)速125 r/min 的條件下反應(yīng)24 h 后，滅菌后置于4 ℃下備用.

1.2.3.3 A.niger 6640 的β-Ffase 反應(yīng)的最佳pH 值優(yōu)選

配制緩沖液A、緩沖液B 的pH 值分別為6.0、6.5、7.0、7.5，加入β-Ffase 粗酶粉0.004g，其他條件不變，進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng).

1.2.3.4 A.niger 6640 的β-Ffase 反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選

在pH=7.0 的緩沖液A 中，分別加入經(jīng)過真空干燥后粗酶和冷凍干燥后粗酶用量均為0.004 g，其他條件不變，在反應(yīng)時(shí)間分別為2、6、10、16、24 h 的條件下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng).

1.2.3.5 A.niger 6640 的β-Ffase 的最適酶用量優(yōu)選

在pH=7.0 的緩沖液A 中，分別加入經(jīng)過真空干燥的β-Ffase 粗酶粉0.04、0.09、0.14、0.19、0.24 g，其他條件不變，進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng).

1.2.3.6 A.niger 6640 的β-Ffase 的分離純化和初步鑒定

取400 mL 發(fā)酵后的黑曲霉菌液，經(jīng)已滅菌的400 目濾袋過濾，用pH =7.0 的50 mmol/L 的Tris-HCL 緩沖液洗滌兩次，在30 MPa 壓力下破碎細(xì)胞后，離心10 min(10 ℃、8000 r/min)，取上清液300 mL，在上清液中加入-20 ℃冷凍丙酮250 mL 進(jìn)行沉淀，離心10 min(10 ℃、8 000 r/min)，回收丙酮，迅速用10 mL 的50mmol/L 的Tris-HCL 緩沖液溶解沉淀，離心10 min(10 ℃、8 000 r/min)后，取上清液9 mL 上樣.用蒸餾水將陰離子層析柱DEAE Sepharose CL-6B中的乙醇沖洗干凈，再用pH =7.0 的50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液沖洗柱子至平衡，將上樣液裝入柱子中，用50 mmol/L 的Tris-HCL 緩沖液和0.7 g/mL 的NaCl 的Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行1 ∶1 混合洗脫，在280 nm波長下，測定收集管中吸光值，以A280nm值為縱坐標(biāo)，洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，作洗脫曲線，測定每個(gè)收集管的酶活，合并有酶活的洗脫液后進(jìn)行真空濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳.

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵產(chǎn)物中的FOS含量

黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵后樣品中的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的HPLC 圖譜如圖1所示.由圖1可知，蔗果四糖和蔗果五糖難以分開，出峰時(shí)間同為8.410 min，蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的出峰時(shí)間分別為8.855 、9.725 、11.504 和14.610 min.根據(jù)蔗果低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度和出峰面積，計(jì)算得蔗果四糖和蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y =108 871.67X，回歸系數(shù)r2=0.999;蔗果三糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y =145 858.95X，回歸系數(shù)r2=0.999，式中X 為糖組分的質(zhì)量濃度，單位為g/L，所使用的色譜柱為鈣離子色譜柱Rezex RCM-Monosaccharife Cat，該色譜柱的特點(diǎn)是使用壽命長，流動(dòng)相為蒸餾水，容易保存.在GB/T23528—2009 中，規(guī)定測定低聚果糖的總含量，對蔗果三糖、四糖及五糖等單體低聚糖的含量沒有明確的要求，因此使用鈣離子色譜柱Rezex RCM-Monosaccharife Cat 完全能達(dá)到分析的要求.

圖1 A.niger 6640 發(fā)酵后樣品中的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的HPLC 圖Fig.1 HPLC profile of 1-kestose，nystose，1F-fructofuranosylnystose，sucrose，glucose and fructose production by A.niger 6640

2.2 黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的條件

2.2.1 pH 值對A.niger 6640 制備FOS 的影響

不同pH 值對黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響如圖2所示.從圖2可知，隨著pH 值增加，F(xiàn)OS 含量先增高后降低，在pH =7.6 時(shí)達(dá)到最高，為361.24 g/L;FOS 相對百分比的變化情況與FOS 含量一致，在pH =7.6 時(shí)，F(xiàn)OS 相對百分比也達(dá)到最高，為67.5 %.pH 值過高或過低都會對發(fā)酵產(chǎn)生影響，在其最佳pH 值(7.6)條件下，蔗糖的轉(zhuǎn)化率最大.該pH 值與Xanthophyllomyces dendrorhous最適pH 值(7.0)類似［12］，但高于A.niger 的pH =5.0 ～5.5［13］，可能是由于微生物種類的不同而導(dǎo)致β-Ffase 的最適pH 值不同，后續(xù)的β-Ffase 的初步鑒定也表明菌株來源不同，該酶的分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)也會不同.

圖2 p H 值對FOS 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of FOS

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對A.niger 6640 制備FOS 的影響

發(fā)酵時(shí)間對黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS的影響如圖3所示.從圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，F(xiàn)OS 含量先升高，在發(fā)酵時(shí)間為40 h 時(shí)達(dá)到最大，為252.24 g/L，此后FOS 含量下降，可能是營養(yǎng)物質(zhì)不足及有害物質(zhì)積累，F(xiàn)OS 可能發(fā)生水解反應(yīng)而使含量下降，在Aspergillus sp pullulans 27H 中也有類似的結(jié)果［14］.FOS 相對百分比與含量變化趨勢一致，在40 h 時(shí)，最大為65.7%.

圖3 發(fā)酵時(shí)間對FOS 產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of FOS

2.2.3 發(fā)酵溫度對A.niger 6640 制備FOS 的影響

發(fā)酵溫度對黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS的影響如圖4所示.從圖4可知，最佳發(fā)酵溫度為33 ℃，F(xiàn)OS 含量為327.89 g/L，F(xiàn)OS 相對百分比也達(dá)到最高，為62.7%.該溫度同Aspergillus oryzae KB 發(fā)酵制備FOS 的溫度相同，低于40 ℃，當(dāng)發(fā)酵溫度低于40 ℃時(shí)，β-Ffase 的熱穩(wěn)定性不高，反應(yīng)液易被污染，建議通過交聯(lián)等方式修飾酶的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性［15］.

圖4 發(fā)酵溫度對FOS 產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of FOS

2.2.4 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黑曲霉A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的影響如圖5所示.從圖5可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，F(xiàn)OS 含量先升后降，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)達(dá)到最高，為306.42 g/L;FOS 相對百分比的變化趨勢與產(chǎn)量變化趨勢相差較大，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在不斷降低，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時(shí)最高，為63.5%，此時(shí)FOS 含量為284.31 g/L，F(xiàn)OS含量最高時(shí)，其FOS 相對百分比為57.1%.底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以影響菌種的滲透壓從而影響酶活性，因此，選擇最佳的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以使酶達(dá)到最佳反應(yīng)效果且不會造成原料的浪費(fèi).為了獲得較高的FOS 相對百分比，選擇蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，且FOS 含量也較高，因此，最適蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 %.該值同X.dendrorhous 的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)一致，隨著蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，蔗糖水解酶活性逐漸下降，但β-Ffase 活性不斷提高，形成較多的低聚糖［12］.

圖5 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對FOS 產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of sucrose mass fraction on the yield of FOS

2.3 黑曲霉A.niger 6640 中β-Ffase 粗酶的酶學(xué)性質(zhì)表征

對1.2.3.1 節(jié)中真空冷凍干燥和真空干燥兩種方法制備的β-Ffase 粗酶粉的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究.

2.3.1 A.niger 6640 的β-Ffase 催化反應(yīng)的最佳反應(yīng)pH 值

選擇合適緩沖液和pH 值可節(jié)省酶的用量，在緩沖液A 和B 中，用兩種方法制備的β-Ffase 粗酶在不同pH 值中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖6所示.

圖6 pH 值對β-Ffase 粗酶催化制備FOS 的影響Fig.6 Effect of pH on the yield of FOS biotransformed by β-Ffase

從圖6可知，在緩沖液A 中，隨pH 值增加，經(jīng)真空干燥的粗酶催化產(chǎn)生的FOS 的相對百分比先升后降，在pH=6.5 達(dá)到最大，為11.8%;隨pH 增加，經(jīng)真空冷凍干燥的粗酶催化產(chǎn)生的FOS 的相對百分比也是先升后降，在pH 值6.5 ～7.0 之間，F(xiàn)OS相對百分比穩(wěn)定為11.4 %;而在緩沖液B 中，隨著pH 值增加，經(jīng)兩種方法制備的β-Ffase 粗酶催化產(chǎn)生的FOS 的相對百分比都逐漸降低，經(jīng)真空干燥制備的β-Ffase 粗酶催化產(chǎn)生的FOS 相對百分比略高，但是最大值都小于緩沖液A 的最大值.綜上所述，經(jīng)過兩種干燥工藝制備的β-Ffase 粗酶，在緩沖液A 中的催化效果都比在緩沖液B 中好;在緩沖液A 中，兩種干燥工藝制備的β-Ffase 粗酶的催化結(jié)果(FOS 含量和FOS 相對百分比)相差很小，但真空冷凍干燥能耗遠(yuǎn)高于真空干燥，因此，在后續(xù)的研究中選擇真空干燥工藝制備β-Ffase;從結(jié)果還可推測本研究中β-Ffase 可耐受50 ℃的高溫;另外，β-Ffase 最適pH 值為6.5，與菌株A.niger 6640 直接發(fā)酵的最適pH 值不同，可能因?yàn)榫曛袕?fù)雜的酶系會影響β-Ffase 的催化效果.

2.3.2 A.niger 6640 的β-Ffase 催化反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間

經(jīng)兩種干燥方法制備β-Ffase 在緩沖液A 中經(jīng)不同反應(yīng)時(shí)間后結(jié)果如圖7所示.從圖7可知，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，兩種干燥方法制得的粗酶催化產(chǎn)生的FOS 的相對百分比都是先升后降，在反應(yīng)16 h 時(shí)達(dá)到最大，分別是10.6%和8.1%.真空干燥與真空冷凍干燥工藝相比，其FOS 相對百分比均高于后者，因此，真空干燥工藝更適合于β-Ffase 粗酶，最佳反應(yīng)時(shí)間為16 h.

圖7 反應(yīng)時(shí)間對β-Ffase 粗酶催化制備FOS 的影響Fig.7 Effect of reactive time on the yield of FOS biotransformed by β-Ffase

2.3.3 A.niger 6640 的β-Ffase 催化反應(yīng)的最適酶用量

在緩沖液A 中，經(jīng)真空干燥制得的β-Ffase 粗酶在不同酶用量下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖8所示.

圖8 酶用量對β-Ffase 粗酶催化制備FOS 的影響Fig.8 Effect of enzyme concentration on the yield of FOS biotransformed by β-Ffase

從圖8可知，隨著酶用量增加，催化產(chǎn)生的FOS的相對百分比先升后降，在酶用量為0.19 g 時(shí)達(dá)到最大，為50.4%.酶用量是催化反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵因素，酶用量太少則使反應(yīng)時(shí)間過長而使轉(zhuǎn)化率低，若酶用量太多會造成浪費(fèi)，因此選擇合理的酶用量非常重要，本研究中最佳酶用量為0.19 g.

2.3.4 A.niger 6640 的β-Ffase 的分離純化和初步鑒定結(jié)果

β-Ffase 分離純化后的洗脫曲線如圖9所示.從圖9可知，當(dāng)洗脫液NaCl 的質(zhì)量濃度為0.1 ～0.2 g/mL時(shí)，14-18 管有較強(qiáng)酶活，19-23 管也有少量酶活，將這些洗脫液分別合并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果如圖10所示.從圖10中可知，從上往下，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分子量大小分別為97、66、53、36 ku，有較強(qiáng)β-Ffase 酶活的14 -18 管有3 條明顯蛋白質(zhì)條帶，第1 條的分子質(zhì)量約為75ku，在19 -23 管也有一條與此接近的條帶，該條帶最可能是目標(biāo)β-Ffase 蛋白，這與Guimar?es 等［16］從A.ochraceus 中分離出的β-Ffase 的分子質(zhì)量79 ku 相似，álvaro-Benito 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，酵母中β-Ffase 的平均分子質(zhì)量為60 ～65 ku ，Chen 等［18］從X.dendrorhous分離出的β-Ffase 的分子質(zhì)量為33 ku .

圖9 β-Ffase 的洗脫曲線Fig.9 The elution curve of β-fructofuranosidase

圖10 β-Ffase 的電泳圖Fig.10 Gel electrophoresis photo of β-fructofuranosidase

3 結(jié)論

對自主篩選的耐高溫菌株黑曲霉A.niger 6640發(fā)酵制備FOS 的條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究了通過不同工藝從黑曲霉A.niger 6640 中制得的β-Ffase 粗酶的酶學(xué)性質(zhì)，并對A.niger 6640 中的β-Ffase 粗酶進(jìn)行了初步的分離純化和鑒定，得出以下主要結(jié)論:

(1)A.niger 6640 發(fā)酵制備FOS 的最佳pH 值為7.6、最佳發(fā)酵時(shí)間為40h、最佳發(fā)酵溫度為33℃、最佳蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%;

(2)真空干燥工藝較為合適A.niger 6640 中的β-Ffase 粗酶的制備;

(3)在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，從A.niger 6640 中制得的β-Ffase 的催化反應(yīng)的最佳pH 值為6.5、最佳反應(yīng)時(shí)間為16 h、最適酶用量為0.19 g;

(4)SDS-PAGE 電泳分離出一條分子質(zhì)量約為75 ku 的蛋白質(zhì)條帶，很可能為β-Ffase.

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