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    高山被孢霉產花生四烯酸育種及發(fā)酵調控研究進展

    2015-12-18 18:19:01孫立潔陳祥松袁麗霞吳金勇姚建銘
    安徽農業(yè)科學 2015年33期
    關鍵詞:孢霉原生質烯酸

    凌 瑞,孫立潔,2*,陳祥松,袁麗霞,吳金勇,潘 淼,姚建銘*

    (1.中國科學院合肥物質科學研究院等離子體物理研究所,安徽合肥230031;2.中國科學院湖北產業(yè)技術創(chuàng)新與育成中心,湖北武漢430072)

    花生四烯酸(Arachidonic acid,簡稱 AA、ARA),即全順式-5,8,11,14-二十碳四烯酸,是人體中最重要的一種不飽和脂肪酸(PUFA),在腦和神經(jīng)組織中的含量占總PUFA 40%~45%。花生四烯酸在機體內可呈現(xiàn)多種功能,它是生物體內合成多種二十烷類的前體,如前列腺素(Prostaglandins)、白細胞三烯(Leukotrienes)、血栓烷素(Thromboxanes)等,這些生物活性物質對脂質蛋白的代謝、血管彈性、白細胞功能和血小板激活等人體免疫及心血管系統(tǒng)具有重要的作用。另外,ARA對促進嬰幼兒大腦發(fā)育也具有重要意義,尤其對自身合成量較低的嬰幼兒而言,補充花生四烯酸尤為重要。國家衛(wèi)生部在1999年正式批準花生四烯酸作為新型營養(yǎng)強化劑。目前,花生四烯酸已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織等國際權威機構推薦,作為營養(yǎng)劑補充添加到嬰兒配方奶粉中,2012年衛(wèi)生部頒發(fā)《食品安全國家標準-食品營養(yǎng)強化劑使用標準》(GB 14880—2012),花生四烯酸作為食品添加劑確定為來源于高山被孢霉(Mortierella alpina)。筆者對高山被孢霉產花生四烯酸的育種及發(fā)酵調控研究進展進行了綜述,并對其研究前景進行了展望。

    1 高山被孢霉產花生四烯酸的育種

    為實現(xiàn)高山被孢霉發(fā)酵過程達到高效低耗,進一步提高花生四烯酸的產量水平,高產菌種的選育成為前提和基礎。常見的菌種選育方法有經(jīng)典育種法及定向育種。經(jīng)典育種法包括自然選育及誘變育種,而定向育種包括雜交育種及基因工程育種等方法。

    1.1 經(jīng)典育種 經(jīng)典育種包括自然選育及誘變育種,自1987年Nagao Totani等[1]篩選到高產ARA的高山被孢霉菌株以來,國內外對高山被孢霉的菌種選育便廣泛開展,并已取得較大的成效。

    1.1.1 自然選育。一般菌種經(jīng)過多次傳代或長期保藏后,由于自然突變或異核體和多倍體的分離等原因,使有些細胞的遺傳性狀發(fā)生改變,造成菌種不純,在工業(yè)生產中往往采用減少傳代及自然選育的方法以減弱菌種退化。自然選育是指對自然菌株進行分離純化及復壯,這種方法簡單易行,然而較難獲得符合生產要求的優(yōu)良菌株,因此自然選育往往成為輔助手段。

    1.1.2 誘變育種。誘變育種是迄今為止國內外提高產量及發(fā)酵性能的主要手段。對高山被孢霉的誘變育種主要包括3種:物理誘變、化學誘變及生物誘變。

    1.1.2.1 物理誘變。物理誘變具有操作簡單、突變率高、誘變產物對環(huán)境威脅相對較小等優(yōu)勢而得到廣泛應用。常見的物理誘變技術主要有紫外誘變以及α、β、γ射線誘變和離子注入及微波誘變等。

    紫外線誘變是較為普遍的誘變方法,操作簡單、突變率較高,誘變的發(fā)生是由于紫外輻射使DNA分子形成嘧啶二聚體,二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用,并引起雙鏈結構扭曲變形,進而阻礙堿基間的正常配對。2007年王安琪等[2]用紫外線作為誘變劑,分別通過15℃的低溫和0.09 mg/ml乙酰水楊酸的篩選作用,得到2株花生四烯酸產量有較大提高的菌株,分別為LT1112和A1113,花生四烯酸產量分別提高46.41%和53.15%。

    微波輻射屬于一種低能電磁輻射,具有較強生物效應的頻率范圍為300~300 000 MHz,對生物體具有熱效應和非熱效應,使生物體內產生各種生理、生化功能的變化,并表現(xiàn)出頻率和功率的選擇性,在農作物及微生物育種方面已被廣泛應用[3]。2009年李麗娜等[4]采用兩輪微波誘變及菌種篩選AA產量為2.61 g/L,比原始對照菌株提高了3.18倍,且遺傳性能穩(wěn)定。2003年周蓬蓬等[5]采用微波等離子作用高山被孢霉T105,篩選到高產菌R254,該菌的最高生物量達29.3 g/L,油脂11.5 g/L,花生四烯酸 4.20 g/L,花生四烯酸產量為原出發(fā)菌株的1.35倍,進而采用補糖工藝可進一步提高花生四烯酸產量,達到出發(fā)菌株的2.40倍。

    筆者所在課題組最早將離子束誘變應用到微生物育種,并且是全世界最早將離子束誘變技術應用于高山被孢霉的科研單位,通過離子束誘變獲得的高產ARA高山被孢霉菌株已在嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司擴大生產。2000年姚建銘等[6]利用離子束注入技術對高山被孢霉進行誘變,篩選到1株高產菌,可得生物量30.80 g/L,菌體油脂含量達25.8%,花生四烯酸的含量占總脂的45.37%,較出發(fā)菌的AA產率提高了62.36%,且傳代穩(wěn)定。2003年袁成凌等[7]在10 keV、3×1014N+/cm2條件下對高山被孢霉進行離子注入處理,最終獲得1株花生四烯酸高產菌,其發(fā)酵液中的油脂含量近40%,且花生四烯酸得率較對照組提高了約130%。2012年中國科學院等離子體所余增亮等[8]通過離子束注入法進行菌種改良并對溫度、溶氧和pH等進行發(fā)酵培養(yǎng)調控,得到高產菌株,其ARA產率為9.89,已達到國內領先水平。中國科學院等離子體所研究的低能離子束的誘變方法已成功應用于工業(yè)生產中,此方法可以在損傷較輕的前提下獲得更高的突變率和更寬的突變譜,在微生物及水稻誘變育種等領域的成效已得到廣泛應用及關注[9-12]。

    Wang Wenxiang等[13]于2014年采用60Co對高山被孢霉進行不同輻射量的誘變,且通過進一步篩選最終獲得ARA含量提高1.65倍的新菌株,其油脂含量高達40.51%。2004年馬瑞雪等[14]利用深黃被孢霉發(fā)酵法生產多不飽和脂肪酸,并利用60Co對其進行輻射誘變,得到花生四烯酸占油脂含量的32%。

    1.1.2.2 化學誘變。用化學誘變劑處理菌株,以誘發(fā)遺傳物質的突變,進而根據(jù)育種目標對這些變異進行鑒定、培育和篩選,最終育成新品種?;瘜W誘變劑包括烷化劑、堿基類似物、移碼突變劑等,通過改變堿基和基因序列等在DNA復制時發(fā)揮誘變作用。常用作誘變劑的主要有硫酸二乙酯(DES)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、N-甲基-N′-硝基-N 甲基亞硝基胍(MNNG)等。

    周蓬蓬等[15]于2000年采用化學誘變劑硫酸二乙酯(DES)對由高山被孢霉出發(fā)菌株制備的原生質體進行誘變育種。結果表明,采用體積分數(shù)為10%的DES誘變3 min,獲得高產突變株M20,其花生四烯酸產量比對照株提高了4.4倍,而且突變株傳代穩(wěn)定。這說明采用原生質體誘變育種是獲得花生四烯酸高產菌株的有效方法之一,這類烷化劑通過置換DNA分子的氫原子可分別作用于腺嘌呤及鳥嘌呤的N7及N3位點。

    2004年Eiji Sakuradani等[16]用MNNG誘變高山被孢霉得到n-3脫氫酶活性較低的突變株,其ARA產量由3.74 g/L上升至4.97 g/L。MNNG是一種廣泛使用的化學誘變劑和致癌劑,可直接作用于DNA誘發(fā)基因突變及染色體變異。2013年王婷婷等[17]利用紫外線-氯化鋰復合誘變的方式得到的誘變菌株,其AA產量提高了141%。

    1.2 定向育種 定向育種主要包括雜交育種及基因工程育種,其中自然雜交、原生質體融合是雜交育種的主要方法。

    1.2.1 原生質體融合。原生質體融合是指將2個親本的細胞壁用酶解的方法去除,在高滲溶液及助融劑的作用下融合成為異核體,進而達到基因重組的目的。原生質體誘變的優(yōu)點是沒有細胞壁屏障,誘變劑容易進入細胞內,發(fā)生變異的概率更大、時間更短、效率更高,高產花生四烯酸菌株(如深黃被孢霉、輪梗霉等)均已實現(xiàn)原生質體的誘變處理,并且獲得高產菌株。

    2009年于長青等[18]對出發(fā)菌株深黃被孢霉制備的原生質體進行紫外誘變,結果表明經(jīng)過誘變及菌種篩選所獲得高產菌株YZ-124的生物量達到了36.5 g/L,微生物油脂含量為19.2 g/L,花生四烯酸含量達4.72 g/L,并且遺傳性能穩(wěn)定。以輪梗霉發(fā)酵產花生四烯酸也有報道以其原生質體進行誘變處理。2008年趙沫等[19]以輪梗霉紫外誘變突變株為出發(fā)菌株,制備其原生質體并連續(xù)采用紫外線、微波及硫酸二乙酯進行多輪誘變,通過15℃低溫和0.12 g/ml乙酰水楊酸初篩及搖瓶發(fā)酵復篩,得到花生四烯酸產量提高的突變株,其花生四烯酸占總脂肪酸的含量從出發(fā)株的8.03%提高到15.10%。

    1.2.2 基因工程育種?;蚬こ逃N是在分子水平上對基因進行操作的技術,其原理是基因重組,是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞,使導入基因在受體細胞內表達,基因工程育種還包括自有基因的過表達、刪除、修飾和點突變等方法。2011年Wang Lei等[20]對高山被孢霉進行基因測序,結果發(fā)現(xiàn)有近60%的基因參與高山被孢霉脂肪酸代謝途徑中。另外,研究人員對ARA合成途徑中的關鍵酶進行了大量系統(tǒng)的研究工作,克隆到關鍵酶的編碼基因,并進一步將這些關鍵酶的基因在其他缺乏此類酶的生物體系中實現(xiàn)了表達。研究表明,利用基因工程手段改造高山被孢霉以提高ARA的發(fā)酵水平日益受到研究人員的青睞。

    2015年Eiji Sakuradani等[21]通過基因槍法將基因與質粒結合后導入尿嘧啶合成缺陷型菌株,并成功獲得完整型高山被孢霉菌株,該研究首次將基因槍法成功應用于高山被孢霉,必將促進基因槍法在微生物誘變育種上的應用。2012年Zhang Changjie等[22]通過pD4質粒將GLELO基因導入高山被孢霉原生質體中,在Ca2+及PEG的作用下發(fā)生基因重組,且使高山被孢霉發(fā)酵產ARA的含量提高近30%。2005年Seiki等[23]將抗生素Zeocin抗性基因整合到高山被孢霉中,利用該突變株過量表達同源多不飽和脂肪酸延長酶基因,從而增加了ARA的產量。日本科學家落合美佐于2004年以被孢霉屬脂質生產菌的營養(yǎng)缺陷型菌株(如尿嘧啶缺陷型菌株)為宿主進行轉化。采用與此營養(yǎng)缺陷型互補的基因作為標記基因,將該標記基因導入宿主,然后以上述宿主營養(yǎng)缺陷型的回復為標記,篩選轉化株,結果表明GLELO基因導入株中花生四烯酸在總脂肪酸中所占的比例增加18%~42%[24]。基因工程在大腸桿菌中的應用更為廣泛,2004年Dai Minghua等[25]將2株營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌制備原生質體且進行基因重組,最終獲得原養(yǎng)型菌體。

    2 高山被孢霉發(fā)酵調控

    篩選到高產菌株后,若能結合高山被孢霉發(fā)酵調控及AA代謝則會有更好的效果,根據(jù)高山被孢霉的生長、基礎代謝、代謝調節(jié)以及次生代謝合成的特點,進行發(fā)酵過程控制與優(yōu)化。近年來,人們對高山被孢霉的發(fā)酵路徑及代謝調控等進行了大量研究,發(fā)酵調控主要包含碳氮比調控、分批補料、提高溶氧等途徑,ARA代謝則包含切斷或減弱非ARA生物合成的支路代謝、增加前體物的合成、選育△6-脫氫酶活力強的突變株等[26-29]。

    2015年Wu Wenjia等[30]研究表明高山被孢霉發(fā)酵路徑中,ARA的積累主要發(fā)生在幾類重要的脂肪酸后,即發(fā)生在代謝的168~192 h,并以TAG作為主要的積累形式。在發(fā)酵反應體系及培養(yǎng)條件方面,2014年Wang Wenxiang等[31]通過在發(fā)酵過程中的逐步提升溫度及由氣升式反應器替換普通發(fā)酵罐,使ARA產量提升至4.79 g/L。2011年南京工業(yè)大學焦敏等[32]采用最小二乘支持向量機和廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡2種方法建立了花生四烯酸發(fā)酵過程的模型,這為發(fā)酵法產ARA的代謝控制奠定了基礎。在發(fā)酵過程中通過改變一些關鍵的影響因素可以促進ARA的積累,這類研究也比較普遍,如在高山被孢霉不同的培養(yǎng)時間改變溫度、溶氧、添加乙醇等發(fā)人揮脅迫作用等。2010年Chao Peng等[33]研究發(fā)現(xiàn)在高山被孢霉發(fā)酵過程中其生物量的提高及ARA的積累的最適溫度分別為25和20℃,因此在發(fā)酵初期在25℃條件下培養(yǎng)以促進生物量的積累,在發(fā)酵108 h后調整溫度至20℃以促進合成ARA。2010年Chao Peng等[34]通過在高山被孢霉發(fā)酵液添加氧載體正十六烷并在發(fā)酵過程中2次調整溶氧,從而達到提高ARA產量的作用。2008年Ming Jiejin等[35]通過在高山被孢霉發(fā)酵5 L罐中以二步法調整轉速及溶氧,并在發(fā)酵5 d、7 d分別添加3%和5%的乙醇來促進油脂的積累,最終使ARA產量提高了1.7倍。

    3 展望

    近些年,隨著ARA在食品、醫(yī)藥和化妝品等多領域需求的逐步提高,以被孢霉發(fā)酵法生產ARA必將大規(guī)模走向產業(yè)化。目前,用傳統(tǒng)方法進行花生四烯酸菌種選育已有不少研究,且獲得了一些有價值的菌株,但是很多菌株產量仍然不高,且獲得新菌種的周期長、新菌種穩(wěn)定性較差。隨著高山被孢霉基因組測序工作的完成,從大量的功能基因序列中也已定位出有價值的特異基因片斷,從而使人們對ARA生物合成的關鍵酶在分子水平上的認識逐步加深,并且研究人員已成功構建了多種高山被孢霉的轉化系統(tǒng),為今后基因工程育種奠定了基礎。另外,近幾年興起的多基因組工程[36]及全局轉錄機器工程[37]在微生物育種領域的應用也值得關注,其特點是可以深入到基因組及轉錄組層面進行育種,通過靶向改變目的片斷表現(xiàn)出其無可比擬的優(yōu)勢。

    從微生物發(fā)酵生產的角度出發(fā),選育性狀優(yōu)良的生產菌株不可或缺,然而在高山被孢霉發(fā)酵的代謝調控機制、發(fā)酵后處理過程多種脂肪酸的分離以及如何在保證ARA高產的前提下降低二十四碳烷酸的含量等方面仍存在一系列問題,因此,在今后研究中利用新的生物技術對菌種進行選育及發(fā)酵代謝的機理研究將成為必然趨勢。

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