RP-HPLC法測(cè)定黑順片中6種酯型生物堿的含量

王超群，翟宏焱，王曉華

(1.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，合肥 230061； 2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，合肥 230051)

RP-HPLC法測(cè)定黑順片中6種酯型生物堿的含量

王超群1，翟宏焱2，王曉華1

(1.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，合肥 230061； 2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，合肥 230051)

建立黑順片中6種酯型生物堿含量的高效液相測(cè)定方法。采用島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-四氫呋喃(體積比為25∶15)為流動(dòng)相A，以0.1 mol／L乙酸銨溶液(每1 000 mL加冰乙酸0.5 mL)為流動(dòng)相B梯度洗脫，流量為1.0 ml／min，檢測(cè)波長為235 nm，柱溫為35℃。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿進(jìn)樣量分別在0.222～4.430，0.060～1.119，0.144～2.878，0.015～0.297，0.025～0.496，0.011～0.229 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積線性呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 5，檢出限分別為2.10，2.70，2.20，2.60，1.60，3.10 ng，樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的加標(biāo)回收率分別為98.7%～102.2%，98.6%～102.3%，99.0%～101.9%，102.0%～97.3%，102.1%～98.3%，95.7%～103.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.5%，2.5%，2.2%，2.3%，2.2%，1.7%(n=6)。該方法簡便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可為黑順片的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。

黑順片；酯型生物堿；RP-HPLC

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum earm ichaeli Debx)的子根，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、逐風(fēng)寒濕邪的功效［1］，為最具特色的臨床治療陽虛里寒癥的首選藥物。附子主要毒、效成分為烏頭堿類雙酯型生物堿(即新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿)，通過炮制可使既是有效成分又是有毒成分的烏頭堿類雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化成活性及毒性都降低的烏頭堿類單酯型生物堿(即苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿)［2］。附子在炮制加工過程中，雙酯型生物堿分子結(jié)構(gòu)中的乙?；凰饷撊ィ啥拘韵鄬?duì)較低的單酯型生物堿，單酯型生物堿含量保證安全性，而雙酯型生物堿含量保證藥效［3-4］。為控制附子的毒性，必須測(cè)定其中雙酯型烏頭堿的含量，為保證附子提取物的藥效，有必要同時(shí)測(cè)定其中單酯型生物堿的含量，所以最終選擇其中含量較高的3個(gè)單酯型烏頭堿（苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰烏頭次堿）和3個(gè)雙酯型烏頭堿（新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿）進(jìn)行含量測(cè)定。

附子炮制品主要有黑順片、白附片，其中黑順片為臨床常用中藥之一，目前并沒有能夠同時(shí)控制毒性和保證療效的炮制工藝規(guī)范，也無能夠表明附子安全性和有效性的科學(xué)、量化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，由于炮制工藝不盡相同，使得其生物堿的含量差異高達(dá)10倍［5］，難以保障臨床用藥的安全有效。為保證療效及控制藥物的毒性，建立能夠同時(shí)兼顧黑順片安全和有效量化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)非常有必要。近年來，有關(guān)附子的生物堿含量測(cè)定研究較多［6-8］，但對(duì)黑順片中生物堿類成分測(cè)定的高效液相檢測(cè)方法未見報(bào)道。

筆者建立了反相高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)定黑順片中3種雙酯型和3種單酯型生物堿成分的檢測(cè)方法，為有效的評(píng)價(jià)和控制黑順片炮制品質(zhì)量，規(guī)范炮制工藝提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC-20AD型，日本島津公司；

紫外檢測(cè)器：SPD-M20A型，日本島津公司；

色譜數(shù)據(jù)工作站：LC solution型，日本島津公司；

柱溫箱：CTO-20A型，日本島津公司；

自動(dòng)進(jìn)樣閥：SIL-20AC型，日本島津公司；

電子天平：(1)XP56型，瑞士Mettler Toledo公司，(2)BP210S型，德國Sartorius公司；

超聲波清洗器：SB2200-T型，上海奧特賽恩斯儀器公司；

烏頭堿(批號(hào)110720-2004104，純度為100%)，新烏頭堿(批號(hào)799-9403，純度為100%)，次烏頭堿(批號(hào)0798-9403，純度為100%)，苯甲酰新烏頭原堿(批號(hào)111795-200901，純度為99.6%)，苯甲酰烏頭原堿(批號(hào)111794-201102，純度為96.5%)，苯甲酰次烏頭原堿(批號(hào)111796-201002，純度為97.3%)，中國食品藥品檢定院；

乙腈：色譜純；

異丙醇-乙酸乙酯混合溶液：體積比為1∶1；

黑順片飲片：市售；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shimadzu C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈-四氫呋喃(體積比為25∶15)為流動(dòng)相A，以0.1 mol／L乙酸銨溶液(每1 000 mL加冰乙酸0.5 mL)為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL／min；檢測(cè)波長：235 nm；柱溫：35℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)

1.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取6種酯型生物堿對(duì)照品適量，分別以0.05%鹽酸-甲醇溶液溶解并定容至2 mL容量瓶中，配制成苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿質(zhì)量濃度分別為2.215，0.559 7，1.439，0.494 4，0.496 1，0.573 7 mg／mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品溶液1 mL，苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品溶液1 mL，苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品溶液1 mL，新烏頭堿0.3 mL，次烏頭堿0.7 mL和烏頭堿0.2 mL置于10 mL量瓶中，加0.05%鹽酸-甲醇溶液至標(biāo)線，搖勻，配制成苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿質(zhì)量濃度分別為221.5，55.97，143.9，14.83，24.81，11.47 μg／mL的混合對(duì)照品溶液。

1.4 樣品處理

精密稱取黑順片粉末(過3號(hào)篩)2 g，置于具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加異丙醇-乙酸乙酯混合溶液50 mL，稱量，2 h充分潤濕后超聲處理(300 W，40 kHz，水溫25℃以下)30 min，放冷，再稱量，用異丙醇-乙酸乙酯混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，在40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?.05%鹽酸-甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，用0.45μm的微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

對(duì)附子中生物堿提取方法的優(yōu)化，考察了異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)與乙醚兩種溶媒的提取率，結(jié)果見表2。

表2 不同提取溶媒的結(jié)果 μg／g

表2結(jié)果表明，異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)的提取率優(yōu)于乙醚。

2.2 色譜條件的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)［1，9］，高效液相色譜法測(cè)定烏頭類生物堿成分多采用含二乙胺和三乙胺的堿性流動(dòng)相或者酸性乙酸銨為流動(dòng)相，這些流動(dòng)相對(duì)同時(shí)測(cè)定單酯型和雙酯型生物堿不能達(dá)到滿意的分離效果。比較了多種流動(dòng)相，最終選定以乙腈-四氫呋喃(體積比為25∶15)與0.1 mol／L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，并進(jìn)行梯度洗脫，6種生物堿分離度較好，且可在60 min內(nèi)完成1次進(jìn)樣測(cè)定。

2.3 供試液配制溶液的選擇

2010版藥典及其它文獻(xiàn)中供試液的配制大多數(shù)最后是用異丙醇-二氯甲烷(1∶1)溶液定容，考慮到二氯甲烷沸點(diǎn)較低(39.75℃)，易揮發(fā)，毒性較大，且酯型生物堿在堿性條件下易水解，在酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)改用加0.05%鹽酸-甲醇溶液配制對(duì)照品和供試品溶液［10］。

2.4 色譜圖

供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 供試品溶液色譜圖

2.5 線性方程與檢出限

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，按1.2色譜條件測(cè)定色譜峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立6種生物堿線性回歸方程，將對(duì)照品溶液以0.05%鹽酸-甲醇溶液不斷稀釋并進(jìn)行HPLC分析，以信噪比為3倍時(shí)的進(jìn)樣量為檢出限，結(jié)果見表3。

表3 6種生物堿成分的線性關(guān)系

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批黑順片粉末，按1.4方法平行制備6份供試品溶液，并在1.2色譜條件下進(jìn)樣10μL，測(cè)定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的含量，結(jié)果見表4。由表4可知，該法重復(fù)性較好。

表4 6種生物堿重復(fù)性考察結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液，按實(shí)驗(yàn)方法分別在第0，2，4，6，8，12 h 間隔進(jìn)樣10 μL，測(cè)定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿峰面積，結(jié)果見表5。由表5可知，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.52%，1.49%，1.64%，1.38%，0.94%，1.22%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 6種生物堿穩(wěn)定性考察

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取已知苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量的黑順片6份，每份1 g，分別精密加入適量的對(duì)照品苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿，按1.4制備供試品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表6。由表6可知，樣品加標(biāo)回收率較好，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表6 回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取4個(gè)批號(hào)的黑順片飲片，按1.4制備供試品溶液，并在1.2色譜條件下進(jìn)樣10μL，測(cè)定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿色譜峰面積，并計(jì)算以上6種酯型生物堿的含量，結(jié)果見表7。

表7 種酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果 μg／g

從不同產(chǎn)地來源的黑順片6種生物堿含量來看，4個(gè)批次的單酯型生物堿的總量在0.088%～0.13%之間，雙酯型生物堿的總量在0.004 4%～0.008 9%之間。單酯型含量均明顯高于雙酯型生物堿含量。

3 結(jié)語

建立了同時(shí)測(cè)定3種單酯型和3種雙酯型烏頭生物堿的HPLC方法。通過異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)與乙醚兩種不同溶劑對(duì)樣品中生物堿類成分提取率的比較，選擇異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)作為樣品提取溶媒比較合適，通過查閱文獻(xiàn)考察了較多的色譜條件系統(tǒng)，最后選擇乙腈-四氫呋喃(體積比為25∶15)與0.1 mol／L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，并進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果6種不同生物堿分離度較好，且可在60 min內(nèi)完成1次進(jìn)樣測(cè)定。本方法線性范圍寬，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性及成本較低，對(duì)黑順片的質(zhì)量控制和優(yōu)化炮制工藝具有重要的意義。

［1］藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 177.

［2］邵峰，俞瑜，任剛. HPLC法同時(shí)測(cè)定附子理中丸中三種單酯型生物堿含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(16): 57-62.

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Determination of Six Kinds of Ester-Type Alkaloids in Aconiti Lateralis Praeparata by RP-HPLC

Wang Chaoqun1, Zhai Hongyan2, Wang Xiaohua1
(1. Anhui Academy of Medical Sciences, Hefei 230061, China; 2. Anhui Institute for Food and Drug Control, Hefei 230051, China)

The method for simultaneously determining six kinds of ester-type alkaloids in Aconiti Lateralis Praeparata was devolped by HPLC. The column was Shimadzu C18column(250 mm×4.6 mm, 5μm), the mobile phase consisting of acetonitrile-tetrahydrofuran (the wolume ratio was 25∶15, phase A) and 0.1 mol／L ammonium acetate (0.5 mL glacial acetic acid per 1 000 mL, phase B) were used as gradient elution solution with the flow of rate of 1.0 mL／min. The detection wavelength was set at 235 nm with column temperature of 35℃. The linear range of benzoylmesaconitine, benzoylaconitine, benzoylhypaconitine, mesaconitine, hypaconitine and aconitine were 0.222-4.430, 0.060-1.119, 0.060-2.878, 0.015-0.297, 0.025-0.496, 0.011-0.229 μg, respectively, and the correlation coefficients were more than 0.999 5, the sample was steady within 12 h. The detection limits were 2.10, 2.70, 2.20, 2.60, 1.60，3.10 ng, and the average recoveries were 98.7%-102.2%, 98.6%-102.3%, 99.0%-101.9%, 102.0%-97.3%, 102.1%-98.3%, 95.7%-103.5% with RSD of 2.5%, 2.5%, 2.2%, 2.3%, 2.2%, 1.7%(n=6) for benzoylmesaconitine, benzoylaconitine, benzoylhypaconitine, mesaconitine, hypaconitine and aconitine, respectively. This method is simple, accurate, reliable and provides reference for quality evaluation and quality control in Aconiti Lateralis Praeparata.

Aconiti Lateralis Praeparata; ester-type alkaloids; RP-HPLC

O657.7

A

1008-6145(2015)02-0062-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.02.018

聯(lián)系人：王曉華；Email: 1210wxh@sina.com

2015-12-08