左旋肉堿改善順鉑誘導(dǎo)腎損傷機制的相關(guān)研究

李 敏，那 宇，高建軍

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍306臨床學(xué)院;2.中國人民解放軍306醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100101)

左旋肉堿(即左卡尼汀，L-carnitine)，又稱維生素BT，是一種廣泛存在于機體組織內(nèi)的特殊氨基酸，是動物能量代謝必需的體內(nèi)天然物質(zhì)，其在脂肪代謝中發(fā)揮重要作用，并具有抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用。近年來多項研究顯示左旋肉堿對順鉑誘導(dǎo)的腎損傷具有明顯的保護作用，其主要機制綜述如下。

1 左旋肉堿的藥理作用

左旋肉堿可在體內(nèi)由賴氨酸和蛋氨酸內(nèi)合成而來，亦可通過肉類食物外轉(zhuǎn)換獲取，同時谷物、水果和蔬菜也可少量提供。充足的左旋肉堿對脂肪酸代謝和酰基輔酶A中間體的線粒體解毒作用是十分必要的。因催化脂肪酸氧化的酶均存在于線粒體基質(zhì)中，活化的脂酰輔酶A(CoA)分子必須經(jīng)肉毒堿穿梭系統(tǒng)將胞質(zhì)中的脂酰CoA轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)才能進行氧化分解。肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和Ⅱ是一組同工酶，前者存在于線粒體內(nèi)膜外側(cè)，催化脂酰CoA上的脂?；D(zhuǎn)移給肉堿，生成脂酰肉堿;后者位于線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，將轉(zhuǎn)入的脂酰肉堿上的脂?；匦罗D(zhuǎn)移給線粒體基質(zhì)中的CoA，游離的肉堿則被運回內(nèi)膜外循環(huán)使用。左旋肉堿將形成脂肪酸所需的長鏈酰基從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)運至線粒體，使脂肪酸得以順利轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A實現(xiàn)β氧化生成能量，同時其可抑制長鏈脂肪酸異常升高對磷脂雙分子層的破壞，穩(wěn)定線粒體膜，從而通過這一機制發(fā)揮抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)其主要藥理作用并不局限于此，尚需進一步研究。

2 順鉑誘導(dǎo)的腎損傷

順鉑是一種高效廣譜的抗腫瘤藥物，易出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、耳毒性等不良反應(yīng)，因其有在腎臟高聚集、高排泄和高代謝的特點，劑量依賴性腎損傷的表現(xiàn)尤為突出，?？上拗祈樸K在臨床上的應(yīng)用。順鉑引起的腎損傷范圍廣泛，包括急性腎損傷、遠(yuǎn)端腎小管酸中毒、腎濃縮功能障礙、一過性蛋白尿、高尿酸血癥、類Fancon綜合征、低鎂血癥、低鈣血癥、促紅細(xì)胞生成素缺乏、血栓形成性微血管病和慢性腎功能衰竭等。順鉑同時也是一種強有力的氧化還原物質(zhì)，能生成有毒的活性氧，從而導(dǎo)致各種細(xì)胞和組織的氧化損傷。由于腎臟的特殊結(jié)構(gòu)，這種氧化作用對其損傷巨大。順鉑性腎損傷的基本過程包括以下幾方面:藥物在腎實質(zhì)上皮細(xì)胞的累積，腎臟通過γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶代謝活化使毒性增強，DNA鏈間鏈內(nèi)交聯(lián)和隨后的DNA損傷的形成，線粒體DNA和呼吸功能受損，凋亡通路的激活和炎癥反應(yīng)的啟動［1］。

3 左旋肉堿對順鉑誘導(dǎo)腎損傷的保護作用

3.1 抗氧化作用 線粒體含有自身獨特的環(huán)狀裸露DNA，極易發(fā)生突變和遭受攻擊。作為細(xì)胞氧化功能中心，線粒體在能量代謝、自由基產(chǎn)生、衰老、細(xì)胞凋亡中起重要作用［2］。順鉑可直接損傷線粒體DNA，或產(chǎn)生大量自由基攻擊及改變離子轉(zhuǎn)運蛋白活性進而破壞細(xì)胞離子平衡，改變線粒體通透性，降低跨膜電位，從而影響腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能，導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)生成障礙。線粒體損傷可使氧化呼吸鏈功能受損，引起活性氧生成增加和聚集，自由基產(chǎn)生過多。順鉑腎毒性既與抑制腎皮質(zhì)清除自由基的能力，導(dǎo)致自由基增多，脂質(zhì)過氧化增強有關(guān);也與通過降低多種自由基清除酶的活性，使自由基清除減少，加重氧化應(yīng)激有關(guān)。王黎等［3］研究了脂質(zhì)過氧化在順鉑誘導(dǎo)腎損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)丙二醛(MDA)含量升高，超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性降低，且腎皮質(zhì)SOD、GPx活性與肌酐、尿素氮含量呈負(fù)相關(guān)，而MDA呈正相關(guān)。MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，SOD、GPx是體內(nèi)最重要的自由基清除劑。證明了順鉑引起的腎損傷與腎皮質(zhì)脂質(zhì)過氧化增強有關(guān)，且隨劑量增加腎皮質(zhì)損傷加重。

自由基生成的先決條件是線粒體電子傳遞系統(tǒng)釋放自由電子，左旋肉堿可阻斷該反應(yīng)的進行。多個研究表明左旋肉堿可以對抗氧化應(yīng)激，其通過清除過氧化氫和超氧自由基以及螯合過渡金屬離子發(fā)揮抗氧化作用，同時左旋肉堿還可改善過氧化損傷中GPx，過氧化氫酶(CAT)和SOD的活性從而保護內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)［4］。Chang等［5］根據(jù)左旋肉堿的抗氧化特性評估了其在順鉑誘導(dǎo)腎損傷中的預(yù)防性保護作用，結(jié)果顯示左旋肉堿可明顯抑制順鉑引起的肌酐及尿素氮的升高，改善近端小管細(xì)胞的損害，同時有效阻止MDA的升高。順鉑也可引起腎皮質(zhì)完整線粒體DNA數(shù)量顯著減少，而左旋肉堿能防止這些發(fā)生。在極譜分析法測試中，可觀察到左旋肉堿治療顯著抑制了順鉑引起的線粒體呼吸控制指數(shù)的下降。由此推斷氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是參與順鉑誘導(dǎo)腎損傷的發(fā)病機制之一，而左旋肉堿可以抑制順鉑導(dǎo)致的線粒體功能障礙、DNA損害、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和腎臟上皮細(xì)胞凋亡。同時他們也研究了左旋肉堿對順鉑抗癌性的影響，發(fā)現(xiàn)左旋肉堿并沒有減弱順鉑的抗腫瘤作用。

Cayir等［6］同樣驗證了氧化應(yīng)激是順鉑腎毒性的一個機制。與對照組相比，順鉑組MDA生成增多，谷胱甘肽(GSH)、GPx、谷胱甘肽 s-轉(zhuǎn)移酶(GST)和SOD的組織活性明顯降低，而補充左旋肉堿后這些指標(biāo)均有所恢復(fù)。左旋肉堿的天然短鏈衍生物，丙酰左旋肉堿，可完全逆轉(zhuǎn)順鉑導(dǎo)致的組織GSH的降低和腎硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)及硝酸鹽/亞硝酸鹽(NOX)總量的升高，而后兩種指標(biāo)反映了脂質(zhì)過氧化的程度［7］。

目前抗氧化應(yīng)激被認(rèn)為是左旋肉堿保護順鉑腎毒性最主要的作用機制，其通過清除自由基、減少脂質(zhì)過氧化、增加線粒體ATP生成等改善順鉑引起的氧化改變和組織病理學(xué)損傷。

3.2 抗炎作用 大量研究提示，級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)可能是順鉑誘導(dǎo)的急性腎功能損傷的重要原因之一［8］。順鉑產(chǎn)生的羥自由基參與p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化，介導(dǎo)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的合成。TNF-α可激活促炎細(xì)胞因子和趨化因子，使白細(xì)胞聚集，誘發(fā)氧化應(yīng)激，引起腎小管、腎小球和腎實質(zhì)細(xì)胞損傷和壞死，表現(xiàn)為急性腎損傷。TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，ROS激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)，后者又誘使促炎細(xì)胞因子如TNF-α的產(chǎn)生，從而陷入惡性循環(huán)，加劇腎臟損害［9］。

左旋肉堿可有效降低血清中的炎癥因子，從而改善心、肺、腎等重要臟器衰竭時的炎癥狀態(tài)，如慢性充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺病及維持性血液透析的微炎癥狀態(tài)等。通過抑制外周血單核細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白水平和c-Jun氨基末端激酶(JNK)活性，抑制外周血單核細(xì)胞的活性和促炎癥因子的產(chǎn)生［10］。在左旋肉堿改善順鉑耳毒性的研究中發(fā)現(xiàn)左旋肉堿可顯著改善順鉑引起的耳蝸毛細(xì)胞中多種促炎細(xì)胞因子的升高［11］。但關(guān)于左旋肉堿通過調(diào)節(jié)炎癥因子改善順鉑腎毒性的相關(guān)詳細(xì)報道并不多見，還有待進一步研究。

3.3 抗凋亡作用 順鉑可引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，具有劑量及時間依賴性，不同濃度和作用時間引起細(xì)胞死亡的方式不同。低濃度順鉑(8 μmol·L-1)可引起細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮，染色體濃縮及核碎裂。而高濃度的順鉑(800 μmol·L-1)直接引起腎小管上皮細(xì)胞壞死，出現(xiàn)胞漿腫脹，胞漿完整性消失。Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶，凋亡的發(fā)生即通過Caspase實現(xiàn)的。在一定條件下，啟動子Caspase自身催化激活后引起一系列下游Caspase的激活，從而引發(fā)凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡有三條主要通路，即線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑、死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。順鉑引起的凋亡過程涉及上述3種通路，最終都導(dǎo)致Caspase-3/7活性升高，出現(xiàn)凋亡的典型表現(xiàn)［12］。其中線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑作用最重要，在此通路中細(xì)胞色素C從線粒體釋放分別導(dǎo)致Caspase-8及Caspase-9的激活，進一步引起Caspase-3的活化，而 Caspase-3在凋亡過程中起核心作用［13］。

左旋肉堿具有抗凋亡作用，可抑制Fas分子誘導(dǎo)的凋亡，降低重組Caspase-3、8、9的活性。Tufekci等［14］證明了肉堿的抗凋亡作用可減弱順鉑引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。在注射順鉑后給予乙酰左旋肉堿(ALCAR)可顯著改善順鉑引起的Caspase-3、8、9活性的升高，減輕順鉑導(dǎo)致的腎組織損傷。證明了內(nèi)源性線粒體途徑在順鉑腎損傷中的作用及ALCAR在順鉑引起腎臟細(xì)胞凋亡中起保護作用。順鉑引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)又可使脂肪酸游離體增加，游離的脂肪酸與線粒體內(nèi)電壓依賴性通道反應(yīng)，引起細(xì)胞膜通透性的快速改變，并將細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放出來，進一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

Fas分子是死亡受體的代表，與配體結(jié)合后可通過其胞內(nèi)段的死亡域和胞質(zhì)中銜接蛋白FADD(Fas相關(guān)死亡域蛋白)間的相互作用增強Caspase-8酶原的弱蛋白水解活性，啟動Caspase級鏈反應(yīng)，激活下游的效應(yīng)Caspase，通過死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體途徑中細(xì)胞色素C使Caspase-9酶原間相互靠近自我剪切而活化［15］，活性 Caspase-9作為蛋白酶激活 Caspase-3、7。而Caspase-9也參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中Caspase-12途徑［16］。最終均通過激活凋亡效益蛋白Caspase-3啟動凋亡的發(fā)生。因而左旋肉堿在順鉑腎毒性中的抗凋亡作用可能是通過線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑共同完成的。

3.4 改善肉堿缺乏 左旋肉堿主要在腎臟代謝，經(jīng)腎小球濾過后，85%以上經(jīng)腎小管重吸收進入血液循環(huán)，其余主要以?；笮鈮A形式從尿液排出。順鉑可引起腎小管上皮細(xì)胞急性壞死、變性，間質(zhì)水腫，腎小管擴張、重吸收功能降低及腎小球濾過率減少，從而引起肉堿生成及重吸收減少，造成體內(nèi)肉堿缺乏。肉堿/有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白2(OCTN2)是肉堿分子膜通透性的決定因素，對肉堿的轉(zhuǎn)運具有重要意義［17］，而順鉑可通過下調(diào) OCTN2的表達影響尿液肉堿水平［18］。

肉堿缺乏是否是順鉑腎毒性的一個危險因素，補充左旋肉堿能否通過提高肉堿濃度從而減輕順鉑導(dǎo)致的腎損傷?Sayed-Ahmed等［19］通過實驗給出了答案。肉堿有左旋和右旋兩種構(gòu)象，體內(nèi)具有生物活性的是左旋肉堿，右旋肉堿不僅沒有生物活性還會與左旋肉堿產(chǎn)生競爭關(guān)系，造成肉堿缺乏。通過腹腔注射右旋肉堿可制備左旋肉堿缺乏大鼠模型。實驗結(jié)果顯示順鉑組腎組織總?cè)鈮A量顯著減少，右旋肉堿組腎肉堿缺乏是由于左旋肉堿的耗盡，與只予右旋肉堿或順鉑組相比，右旋肉堿和順鉑聯(lián)合用藥導(dǎo)致腎肉堿水平降低更明顯，而順鉑注射前/后給予左旋肉堿可使腎肉堿總量基本恢復(fù)正常。不過這幾組治療都沒有引起血漿肉堿水平發(fā)生顯著變化。順鉑治療組腎組織ATP水平降低，左旋肉堿可改善ATP的消耗而右旋肉堿不能。與單獨予順鉑治療組相比，順鉑+右旋肉堿組顯示腎組織損傷更加嚴(yán)重，而左旋肉堿+順鉑組的大鼠腎組織退行性變化最少。左旋肉堿可改善順鉑引起的腎功能衰竭，而右旋肉堿則相反。總之，該實驗的數(shù)據(jù)說明腎肉堿缺乏可能是參與順鉑致腎毒性的一種風(fēng)險因素或機制，補充左旋肉堿可減輕順鉑所致的腎功能損傷。

3.5 調(diào)節(jié)基質(zhì)重塑 順鉑導(dǎo)致的腎毒性對腎臟既有急性作用也有慢性影響:急性變化是由于順鉑對腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，而慢性改變可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化是順鉑的一個主要并發(fā)癥，這是由于腎細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的不斷聚集，而基質(zhì)重塑對正常組織的生成十分重要?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)重塑中發(fā)揮重要作用，特別是MMP-9參與了腎臟ECM的正常降解［20］。腎小管上皮細(xì)胞和基底膜的相互變化在腎小管萎縮起關(guān)鍵作用，MMP-9生成增多對結(jié)構(gòu)的改變有決定性作用。生理狀態(tài)下，ECM的合成及降解是由蛋白水解基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其組織抑制劑(TIMPs)的相互作用來平衡的。

Martinez等［21］研究了 MMP-9與 TIMP-3在左旋肉堿保護順鉑性腎損傷中的變化，發(fā)現(xiàn)順鉑治療15 d的大鼠腎小球和腎小管區(qū)域的MMP-9表達明顯增強，TIMP-3的活性顯著降低，表明基底膜退化，ECM成分改變及腎小球功能降低，最終導(dǎo)致腎小球膜增厚。左旋肉堿治療15 d的大鼠MMP-9活性普遍減弱，TIMP-3在腎臟表達能力的恢復(fù)可能與腎小球系膜ECM中MMP-9的表達減少有關(guān)。表明MMP-9和TIMP-3參與的基質(zhì)重塑在順鉑治療后發(fā)生腎小球硬化和間質(zhì)纖維化中扮演重要角色，左旋肉堿能通過調(diào)節(jié)MMP-9和TIMP-3間的關(guān)系改善順鉑對腎臟的損傷。

總之，左旋肉堿可改善順鉑誘導(dǎo)的腎損傷，減輕腎功能損害程度，防止或減少順鉑引起的腎組織病理性改變。在藥物性腎損傷的臨床治療上具有廣闊的前景。但需注意的是也有報道稱左旋肉堿在順鉑導(dǎo)致的腎損傷中沒有保護作用，考慮可能與用藥劑量同其他實驗的用量不同有關(guān)［22］。而有意思的是Yürekli等［23］的實驗設(shè)計與其大致相同，卻證明了左旋肉堿在順鉑腎毒性的保護作用及定量腎Tc 99m DMSA吸收對檢測順鉑腎毒性及左旋肉堿保護作用的應(yīng)用價值。關(guān)于左旋肉堿改善順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的作用機制尚未完全明確，還有待于進一步的研究和探討。

［1］Miller RP，Tadagavadi RK，Ramesh G，et al.Mechanisms of Cisplatin nephrotoxicity［J］.Toxins(Basel)，2010，2(11):2490-2518.

［2］周一凡，劉春曉.線粒體功能異常引起的疾病研究進展［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，31(4):370-372.

［3］王 黎，楊紅梅，裴 瑞，等.順鉑致大鼠急性腎功能衰竭時腎皮質(zhì)脂質(zhì)過氧化的變化［J］.河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，15(2):1-2，5.

［4］Li JL，Wang QY，Luan HY，et al.Effects of L-carnitine against oxidative stress in human hepatocytes:involvement of peroxisome proliferator activated receptor alpha［J］.J Biomed Sci，2012，19:32.

［5］Chang B，Nishikawa M，Sato E，et al.L-carnitine inhibits cisplatininduced injury of the kidney and small intestine［J］.Arch Biochem Biophys，2002，405(1):55-64.

［6］Cayir K，Karadeniz A，Yildirim A.Protective effect of L-carnitine against cisplatin-induced liver and kidney oxidant injury in rats［J］.Cent Eur J Med，2009，4(2):184-191.

［7］Aleisa AM，Al-Majed AA，Al-Yahya AA，et al.Reversal of cisplatin-induced carnitine deficiency and energy starvation by propionyl-L-carnitine in rat kidney tissues［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2007，34(12):1252-1259.

［8］張 炯，李俊華，肖 芳，等.PPAR-γ激動劑吡格列酮通過抑制炎癥反應(yīng)減輕順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷［J］.臨床腎臟病雜志，2013，13(6):278-281.

［9］萬 婷，李連宏.順鉑腎毒性機制及其防護的研究進展［J/CD］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(14):6623-6625.

［10］Giovanni P，Giuseppe G，Simona S，et al.Inflammation and carnitinein hemodialysis patients［J］.J Ren Nutr，2005，15(11):8-12.

［11］Altun Z，Olgun Y，Ercetin P，et al.Protective effect of acetyl-L-carnitine against cisplatin ototoxicity:role of apoptosis-related genes and pro-inflammatory cytokines［J］.Cell Prolif，2014，47(1):72-80.

［12］Wang X，Grunz-Borgmann EA，Parrish AR.Loss of α(E)-Catenin potentiates cisplatin-induced nephrotoxicity via increasing apoptosis in renal tubular epithelial cells［J］.Toxicol Sci，2014，141(1):254-262.

［13］Pabla N，Dong Z.Cisplatin nephrotoxicity:mechanisms and renoprotective strategies［J］.Kidney Int，2008，73(9):994-1007.

［14］Tufekci O，Gunes D，Ozogul C，et al.Evaluation of the effect of acetyl L-carnitine on experimental cisplatin nephrotoxicity［J］.Chemotherapy，2009，55(6):451-459.

［15］郭 海.Caspase家族與細(xì)胞凋亡及誘發(fā)因素研究進展［J］.河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，24(6):847-850.

［16］Kim EM，Shin EJ，Choi JH，et al.Matrix metalloproteinase-3 is increased and participates in neuronal apoptotic signaling downstream of caspase-12 during endoplasmic reticulum stress［J］.J Biol Chem，2010，285(22):16444-16452.

［17］Tamai I.Pharmacological and pathophysiological roles of carnitine/organic cation transporters(OCTNs:SLC22A4，SLC22A5 and Slc22a21)［J］.Biopharm Drug Dispos，2013，34(1):29-44.

［18］Lancaster CS，Hu C，F(xiàn)ranke RM，et al.Cisplatin-induced downregulation of OCTN2 affects carnitine wasting［J］.Clin Cancer Res，2010，16(19):4789-4799.

［19］Sayed-Ahmed MM，Eissa MA，Kenawy SA，et al.Progression of cisplatin-induced nephrotoxicity in a carnitine-depleted rat model［J］.Chemotherapy，2004，50(4):162-170.

［20］Tsai JP，Liou JH，Kao WT，et al.Increased expression of intranuclear matrix metalloproteinase 9 in atrophic renal tubules is associated with renal fibrosis［J］.PLoS One，2012，7(10):e48164.

［21］Martinez G，Costantino G，Clementi A.Cisplatin-induced kidney injury in the rat:L-carnitine modulates the relationship between MMP-9 and TIMP-3［J］.Exp Toxicol Pathol，2009，61(3):183-188.

［22］Uzunoglu S，Karagol H，Ozpuyan F，et al.Protective effect of L-carnitine versus amifostine against cisplatin-induced nephrotoxicity in rats［J］.Med Oncol，2011，28(Suppl 1):S690-S696.

［23］Yürekli Y，Unak P，Yenisey C，et al.L-carnitine protection against cisplatin nephrotoxicity in rats:Comparison with amifostin using quantitative renal Tc 99m DMSA uptake［J］.Mol Imaging Radionucl Ther，2011，20(1):1-6.