混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)的低酸度川味香腸揮發(fā)性成分分析*

鞏洋，孫霞，楊勇，張楠，郭艷婧，李誠，胡濱，何利

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)

川味香腸是我國特色的傳統(tǒng)腌臘肉制品，其揮發(fā)性物質(zhì)是一種重要的品質(zhì)指標(biāo)，對于川味香腸新產(chǎn)品的開發(fā)、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和質(zhì)量控制有著重要的意義。發(fā)酵香腸的風(fēng)味物質(zhì)形成途徑主要有碳水化合物的分解、脂肪氧化、蛋白質(zhì)的降解，而微生物和環(huán)境條件(溫度和相對濕度)會對風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量產(chǎn)生影響［1-2］。

乳酸菌對香腸的風(fēng)味形成起重要作用，其貢獻(xiàn)主要來自于發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的乙酸和乳酸，同時會產(chǎn)生某些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)［3］。Larrouture 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌具有分解脂肪的能力，脂肪降解產(chǎn)物是發(fā)酵香腸揮發(fā)性成分的重要來源。Papamanoli等［5］從希臘干發(fā)酵香腸中分離的乳酸菌具有分解蛋白的能力，而某些蛋白降解產(chǎn)物是形成發(fā)酵香腸揮發(fā)性成分的前體物質(zhì)。此外還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵香腸中的某些葡萄球菌和微球菌也具有蛋白質(zhì)降解能力，接種此類發(fā)酵劑可以提升發(fā)酵香腸的風(fēng)味［6］。

本研究通過以植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作為發(fā)酵劑并在智能化控溫控濕條件下生產(chǎn)低酸度川味香腸，利用頂空固相微萃取技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)性成分及其相對含量進(jìn)行檢測和分析，比較4組川味香腸揮發(fā)性成分及其相對含量的差異，為進(jìn)一步研究低酸度的川味香腸風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵菌種:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediocossus pentosaceus)、葡萄球菌(Staphylococcus)均由食品學(xué)院肉品研究室從傳統(tǒng)四川香腸中分離得到［7-8］。新鮮豬后腿肉、腸衣、食鹽、白砂糖等調(diào)味料購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

LHS-250SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海榮豐科學(xué)儀器有限公司;DHG29345A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒公司;PHS-3C型酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SW-GJ-IFD型超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)泰安公司;Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀［配有HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)］，美國安捷倫公司;萃取頭 75 μm Carboxen PDMS萃取頭，美國Supelco公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 川味發(fā)酵香腸的制作

本研究在單因素實(shí)驗和正交實(shí)驗等前期工作的基礎(chǔ)上，確定了低酸度川味香腸(pH值為5.50)的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度20℃，發(fā)酵時間12 h，葡萄糖添加量0.10%，發(fā)酵相對濕度75%;成熟溫度13℃，成熟時間4 d，成熟相對濕度60%。

實(shí)驗分為4個處理，以字母A、B、C、D表示。A是接種1∶1∶1比例復(fù)合的植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作為發(fā)酵劑，通過智能化控溫控濕生產(chǎn)的低酸度川味香腸;B是不接種發(fā)酵劑并在智能化控溫控濕條件下生產(chǎn)的川味香腸;C是接種1∶1∶1比例復(fù)合的植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作為發(fā)酵劑，在自然條件下(環(huán)境溫度為8～15℃，相對濕度為75%～90%)生產(chǎn)的川味香腸;D是不接種發(fā)酵劑，在自然條件下(環(huán)境溫度為8～15℃，相對濕度為75%～90%)生產(chǎn)的傳統(tǒng)川味香腸。

發(fā)酵液制備:將植物乳桿菌和戊糖片球菌接種到液體MRS培養(yǎng)基中，將葡萄球菌接種到液體MSA培養(yǎng)基中，在30℃條件下培養(yǎng)24 h，菌種活化2次，血球計數(shù)法計數(shù)，直至達(dá)到106CFU/g以上。

工藝流程:原料肉→預(yù)處理→絞碎→攪拌→接種→灌腸→發(fā)酵→成熟→干燥(55℃，24 h)→成品。

1.2.2 感官評價

采用感官評定之描述定量分析法(quantitative described analysis，QDA)［9］，邀請 10 名有品評經(jīng)驗的人員，分別從滋味(30分)、香氣(30分)、色澤(25分)和外觀(15分)進(jìn)行評定，滿分100分，評定標(biāo)準(zhǔn)見表 1［10］。

表1 川味香腸感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Sichuan-tppe sausage

1.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)檢測

取絞碎的香腸樣品5 g于15 mL頂空進(jìn)樣瓶中，封蓋后在60℃水浴下加熱30 min，將萃取頭插入到頂空瓶中萃取30 min。取出萃取頭插入到GC-MS儀氣相色譜進(jìn)樣口，250℃條件下解析5 min。

講座結(jié)束后，畢宏生與山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院的專家們開展了義診活動，為240余名機(jī)關(guān)干部職工和住地武警官兵作了眼健康體檢。

1.2.4 GC-MS條件

色譜條件:HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm);載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250℃，初始溫度35℃，保持3 min，然后以3.0℃/min升至140℃并保持1 min，再以10℃/min升至250℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件:電子源EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，GC-MS傳輸線溫度280℃;溶劑延遲時間為1.5 min;掃描范圍為50～550 amu。

1.2.5 揮發(fā)性成分的定性定量方法

檢測的未知化合物通過NIST08.LIB標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行對比匹配，取匹配度大于800的鑒定結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確定其化學(xué)成分，利用峰面積歸一化方法計算相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 川味香腸的感官評價結(jié)果

對4種不同加工條件下的川味香腸進(jìn)行感官評價，感官評價結(jié)果見表2。

表2 川味香腸感官評價結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of Sichuan-style sausage

從表2中可以看出，4種川味香腸的感官評分結(jié)果從大到小依次是:A、C、D和B，即人工控溫控濕并接種混合發(fā)酵劑生產(chǎn)的低酸度川味香腸的風(fēng)味相對較好。

2.2 四種川味香腸主要揮發(fā)性成分檢測結(jié)果

采用SPME-GC-MS法分析檢測4種川味香腸的揮發(fā)性成分及相對含量見表3。

2.2.1 四種川味香腸的揮發(fā)性成分種類數(shù)量差異

4種川味香腸中共鑒定出揮發(fā)性成分80種，其中酯類10種，醇類8種，醛類7種，酮類7種，酸類5種，脂肪烴類37種，其他類物質(zhì)6種。A、B、C、D四組川味香腸中分別鑒定出57種、41種、49種和49種揮發(fā)性風(fēng)味成分。其中脂肪烴類和酯類物質(zhì)的種類數(shù)在4種川味香腸中較豐富，但不同工藝條件下生產(chǎn)的川味香腸產(chǎn)品中風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)及個體風(fēng)味成分存在差異。

就個體風(fēng)味成分而言，芳樟醇在4種川味香腸中含量均較高，相對含量均超過10%。除此之外，乙酸芳樟酯和右旋萜二烯在川味香腸中的相對含量也較高。A組(低酸度川味香腸)中含有相對含量較高的乙酸(1.35%)和十六酸(0.85%)，此外乙二酸、甲氧基乙酸和己酸為A組香腸所特有的風(fēng)味成分。

表3 4種川味香腸中揮發(fā)性成分及相對含量測定結(jié)果Table 3 Volatile components and their relative contents four kinds of Sichuan-style sausage

續(xù)表3

2.2.2 四種川味香腸的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量差異

就醇類物質(zhì)而言，川味香腸中醇類的來源比較廣泛，其中大多來源于微生物碳水化合物的代謝，如乙醇;此外，還有一部分來源于脂肪氧化，如1-辛烯-3-醇，由于它閾值較低，因此對川味香腸的風(fēng)味形成具有一定作用，這與Larrouture［4］等研究植物乳桿菌具有脂肪降解能力的結(jié)論相一致。A組香腸中醇類物質(zhì)相對含量為21.29%，高于 B組、C組和D組的17.91%、15.94%和14.63%。雖然醇類物質(zhì)的閾值較高，但它具有香甜花香味，且對醛類和酯類等物質(zhì)的產(chǎn)生必不可少，從而會改善香腸的整體風(fēng)味。

就酯類物質(zhì)而言，它是促進(jìn)川味香腸風(fēng)味形成的重要物質(zhì)，1～10的酸生成的酯一般賦予發(fā)酵香腸果香甜味的特性，能體現(xiàn)發(fā)酵香腸的典型風(fēng)味，如辛酸乙酯具有酒香味，苯甲酸乙酯具有濃烈的蜂蜜香味，己酸乙酯具有果香味［11］。酯類物質(zhì)主要來源于在微生物的作用下，酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)之間進(jìn)行的酯化反應(yīng)。乙酸芳樟酯在4種川味香腸中含量皆為最高，在智能化控溫控濕且接種混合發(fā)酵劑生產(chǎn)的低酸川味香腸中己酸乙酯和辛酸乙酯的含量也較為豐富，這2種物質(zhì)都對低酸度川味香腸的風(fēng)味形成起到重要作用。A組香腸中酯類物質(zhì)的相對含量為22.16%，明顯高于B組、C組和D組的13.67%、13.21%和16.91%。，這與王海燕研究的法式發(fā)酵香腸的接種發(fā)酵劑的42.10%和自然發(fā)酵的25.32%的相似［12］。

就醛類物質(zhì)而言，它具有較低的閾值［13］，因此對發(fā)酵香腸風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)很大。低級醛具有特殊的氣味，通常C3和C4醛具有強(qiáng)烈的刺激性氣味;C5～C9醛具有油蠟和油膩味;C10～C12醛具有檸檬味和橘皮味［14］。A組(低酸度川味香腸)中的種類數(shù)量最多。A組香腸中醛類物質(zhì)相對含量為14.26%，明顯高于B組、C組和 D組的11.68%、10.51%和10.45%。己醛具有清香和草香氣味，是ω-6不飽和脂肪酸的主要講解產(chǎn)物［15］，它既可來源于酯化的亞油酸，又可來源于游離的亞油酸。A組香腸中相對含量較高的個體風(fēng)味成分主要有己醛和壬醛，己醛的含量在4種川味香腸最終最高，高含量的己醛可以明顯的改善香腸風(fēng)味，這與Forss等人的研究結(jié)果相似［16-17］。4種川味香腸中均檢測到了苯甲醛，該物質(zhì)具有苦杏仁味，對川味香腸風(fēng)味的形成具有重要作用。Casaburi［18］等研究發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸是揮發(fā)性風(fēng)味成分的主要前提物質(zhì)，由于乳酸菌對脂肪的分解作用，使得醛類物質(zhì)大量存在于川味香腸中。

就酮類物質(zhì)而言，它一般由美拉德反應(yīng)生成，也可能是脂肪的氧化、降解反應(yīng)等生成［19］。酮類揮發(fā)性成分一般呈奶油味或者果香味，是香氣的重要組成成分，它可以是醇的氧化產(chǎn)物也可以是酯類分解產(chǎn)物，酮類物質(zhì)的閾值很低對發(fā)酵肉制品的風(fēng)味有重要重要作用［20］。在4種川味香腸中，A組酮類物質(zhì)的相對含量為 2.51%，高于 B組、C組和 D組的1.61%、1.74和 1.57%，這與許慧卿［21］等研究接種米酒乳桿菌對發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質(zhì)的影響結(jié)果相似。

就脂肪烴類物質(zhì)而言，A組和C組川味香腸中的種類數(shù)較為豐富，分別為26種和23種。脂肪烴類物質(zhì)主要包括烷烴、烯烴和芳香烴，一般認(rèn)為烴類物質(zhì)呈味閾值較高，對風(fēng)味貢獻(xiàn)不大［22］。β-石竹烯為脂肪烴類的代表成分，為4種川味香腸的共有物質(zhì)，它屬于萜類物質(zhì)，其來源于添加的胡椒粉，具有很強(qiáng)的辛辣風(fēng)味。苯乙烯在A組香腸和C組香腸中被檢測出，相對含量分別為0.23%和0.21%，這種物質(zhì)對改善香腸風(fēng)味具有一定作用。4種川味香腸中脂肪烴類物質(zhì)的差異主要體現(xiàn)在3-蒈烯、羅勒烯和γ-欖香烯這3種成分上。其中，γ-欖香烯是低酸度川味香腸特有的成分。此外，在4種川味香腸中，相對含量較高的物質(zhì)還有檸檬烯、β-月桂烯，其均屬于萜類物質(zhì)。

就酸類物質(zhì)而言，4種川味香腸中，乙酸的相對含量均為最高，微生物對碳水化合物的代謝產(chǎn)生乙酸，植物乳桿菌和戊糖片球菌都是常用的發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑，一般活性較高;此外，除過微生物發(fā)酵途徑，氨基酸與脂肪代謝也會產(chǎn)生乙酸，固有大量乙酸積累［23］。A組和C組川味中乙酸相對含量明顯高于B組和D組，這是由于A組和C組川味香腸中接種了乳酸菌，微生物發(fā)酵的結(jié)果，而A組香腸中乙酸的相對含量為1.35%，其明顯高于C組的0.33%，這是因為A組接種的乳酸菌在較適宜的溫度和相對濕度下生長，微生物代謝旺盛，而C組接種的乳酸菌在較低的環(huán)境溫度下，生長緩慢，代謝較慢所致。此外，A組(低酸度川味香腸)中還檢測到了己酸、乙二酸和甲氧基乙酸，己酸的生成可能是由于乙醇含量較高，其與丁酸反應(yīng)，最終丁酸全部轉(zhuǎn)換成了己酸，其中間產(chǎn)物丁酸也是一種重要的揮發(fā)性物質(zhì)，對川味香腸風(fēng)味的形成具有重要的作用;己酸會進(jìn)一步反應(yīng)生成己酸乙酯［24］，因此A組(低酸度川味香腸)中己酸乙酯和己酸的含量均較高。酸類物質(zhì)在發(fā)酵香腸中是非常重要的風(fēng)味物質(zhì)，它可以促使香腸復(fù)雜風(fēng)味的形成，使發(fā)酵香腸形成其獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味，同時它是酯類生成的中間物質(zhì)。

雜環(huán)類化合物主要來源于還原糖與氨基酸發(fā)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其具有較低的閾值，是發(fā)酵香腸重要的呈味物質(zhì)［25］。2-戊基呋喃在4種川味香腸中均被檢測到，分別為 0.63%、0.36%、0.75%和0.47%，其相對含量較少，它被認(rèn)為是亞油酸的一種氧化產(chǎn)物，具有類似火腿的香味［26］，對改善香腸風(fēng)味具有一定作用。

3 結(jié)論

通過HS-SPME結(jié)合GC-MS可以較好的分析4種不同加工條件下生產(chǎn)的川味香腸的揮發(fā)性成分，其中脂肪烴類、酯類和醇類物質(zhì)是主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中A組(低酸度川味香腸)中酯類、酸類和脂肪烴類物質(zhì)的種類數(shù)較多，而酯類、醇類、和醛類物質(zhì)的相對含量分別為22.16%、21.29%和14.26%，均顯著高于B組、C組和D組。就個體風(fēng)味成分而言，4種川味香腸中芳樟醇、己醛和乙酸芳樟酯的相對含量均較高，除此之外，每種川味香腸中其它相對含量較高的風(fēng)味成分在種類和數(shù)量上均存在較大差異。A組(低酸度川味香腸)中乙酸相對含量明顯高于其它組，此外，乙二酸、甲氧基乙酸和己酸均在低酸度川味香腸中檢測到。4種川味香腸的揮發(fā)性成分主要來自于脂肪的降解氧化、碳水化合物和蛋白質(zhì)在加工過程中的生化反應(yīng)及香辛料和發(fā)酵劑的作用。

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