鈣離子通道β2亞基基因rs4373814位點(diǎn)多態(tài)性與東北漢族人群原發(fā)性高血壓易感性的關(guān)聯(lián)研究

張海英，宋娟娟，李天曉，王懿，呂信鵬，周宏博，鄧穎

鈣離子通道β2亞基基因rs4373814位點(diǎn)多態(tài)性與東北漢族人群原發(fā)性高血壓易感性的關(guān)聯(lián)研究

張海英，宋娟娟，李天曉，王懿，呂信鵬，周宏博，鄧穎

目的：探索鈣離子通道β2亞基（CACNB2）基因rs4373814位點(diǎn)的多態(tài)性與東北漢族人群（黑龍江省及周邊地區(qū)）原發(fā)性高血壓易感性的關(guān)聯(lián)性。

方法：采用病例—對(duì)照研究方法，在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的患者中收集原發(fā)性高血壓患者1 006例作為病例組，體檢人群中隨機(jī)選取同期血壓正常者992例作為對(duì)照組，總計(jì)研究人群1 998例。應(yīng)用Snapshot技術(shù)檢測(cè)CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

結(jié)果：CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)危險(xiǎn)等位基因C的頻率分布在病例組和對(duì)照組間具有顯著性差異[P=0.039，比值比（OR）=1.068，95%可信區(qū)間（CI）：1.004～1.137]。經(jīng)Logistic回歸校正性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒后，發(fā)現(xiàn)顯性模型CC+GC/GG：增加高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567）。

結(jié)論 ：CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與東北漢族人群原發(fā)性高血壓的易感性存在顯著關(guān)聯(lián)。

原發(fā)性高血壓；CACNB2基因；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)研究

Methods: A case-control study in Han population at northeastern of China was carried out and the research included 1998 participants as 2 groups: EH group, n=1006 patients treated in our hospital, and Control group, n=992 subjects with normal blood pressure from physical examination. The rs4373814 polymorphisms were examined by Snapshot technique and the statistical analysis was performed by SPSS 19.0 software.

Results: The rs4373814 risk allele C frequency of CACNB2 gene was significantly different between EH group and Control group, P=0.039, OR=1.068, 95% CI （1.004-1.137）. Logistic regression analysis showed that with adjusted gender, age, BMI, smoking, drinking, in dominant model, the genotype rs4373814 carring CC + GC/GG obviously increased the risk of EH occurrence, P=0.037, OR=1.260, 95% CI （1.013-1.567）.

Conclusion: The rs4373814 polymorphisms of CACNB2 gene are related to the susceptibility of EH occurrence in Han population at northeastern area of China.

1 998例受試者抽取空腹靜脈血300 μl，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，應(yīng)用北京全式金公司生產(chǎn)的血液基因組DNA抽提試劑盒提取人血全基因組DNA（嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作）。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)提取的人全基因組DNA產(chǎn)物片段完整和含量較高后，將DNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱。

1.3 單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)及基因型分析

影響血壓的環(huán)境因素主要包括：高鈉、低鉀膳食、肥胖、吸煙、飲酒、精神緊張等[1，2]。研究表明，原發(fā)性高血壓具有明顯的遺傳傾向，其遺傳度為30%～70%[3]。目前，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展以及人類基因組計(jì)劃的完成，從基因?qū)用嬷謱ふ以l(fā)性高血壓的發(fā)病原因已成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明，鈣離子通道在原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，其β2亞基通過(guò)與α1C亞基結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)鈣離子通道的電流強(qiáng)度、電壓依賴性、激活與失活特性，從而對(duì)血壓產(chǎn)生影響。近年來(lái)國(guó)際上的全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study, GWAS）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個(gè)高血壓的遺傳位點(diǎn)，其中鈣離子通道β2亞基（calcium channel β2 gene， CACNB2）基因的多態(tài)性在歐美、亞洲等地人群中已證實(shí)與原發(fā)性高血壓顯著關(guān)聯(lián)[4-7]。我國(guó)學(xué)者曾在南方地區(qū)漢族人群中進(jìn)行了CACNB2基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)聯(lián)的驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，CACNB2基因多態(tài)性與漢族人群原發(fā)性高血壓的發(fā)生顯著關(guān)聯(lián)[8-11]。研究報(bào)道，中國(guó)漢族人群的基因頻率分布在南北地區(qū)存在差異，關(guān)于CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)的多態(tài)性與原發(fā)性高血壓發(fā)生的關(guān)聯(lián)性研究在東北漢族人群中至今少見報(bào)道。本試驗(yàn)擬研究CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)與東北漢族人群原發(fā)性高血壓發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012-05至2013-05我院住院患者和門診體檢患者共計(jì)1 998例，其中原發(fā)性高血壓患者（病例組）1 006例，血壓正常者（對(duì)照組）992例。所有研究對(duì)象均為長(zhǎng)期居住在黑龍江省及周邊地區(qū)的漢族人群，且無(wú)血緣關(guān)系。

入選標(biāo)準(zhǔn)：病例組：參照2005年世界衛(wèi)生組織及高血壓協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg，或血壓＜140/90 mmHg，且已確診為原發(fā)性高血壓，應(yīng)用降壓藥物治療者，并排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟瓣膜病等。對(duì)照組：同期隨機(jī)選取門診體檢血壓正常者，收縮壓 ＜140 mmHg，舒張壓＜90 mmHg，且無(wú)高血壓家族史。所有入選對(duì)象均為40歲以上的成年人，無(wú)Brugada綜合征、孤獨(dú)癥、 注意力缺損多動(dòng)障礙、躁狂癥、抑郁癥、精神分裂癥等精神類疾病。吸煙者定義為：每天吸煙5支及以上者，且連續(xù)吸煙時(shí)間超過(guò)6個(gè)月或戒煙小于1年。飲酒者定義為：每天飲酒250 ml及以上者，且連續(xù)飲酒時(shí)間超過(guò)1年或戒酒小于1年者。

所有入選研究對(duì)象均簽署知情同意書。研究得到哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可，研究?jī)?nèi)容符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 基因組脫氧核糖核酸（DNA）的提取

采用Snapshot 方法檢測(cè)rs4373814位點(diǎn)的多態(tài)性。（1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增引物序列為F：ATTCCCCTGTAGGGCTATGA，R：AATTCTTTGCCTGCTTTTCTG。PCR反應(yīng)總體積25 μl，其中包括2.5 μl 10×PCR buffer，0.8 μl MgCl2（50 mmol/L），0.5 μl dNTP（10 mmol/L），各0.5 μl的上、下游引物，1 μl模板DNA，0.2 μl tap酶（5U），19 μl ddH2O。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。（2）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照蝦堿酶方法純化，總體積為10 μl，其中包括PCR 產(chǎn)物2 μl ，SAP（1 U/μl）0.3 μl，Exo I（20 U/μl）0.2 μl，ddH2O 7.5 μl，震蕩混勻，37℃孵育90 min，75℃保溫15 min滅活SAP和ExoI酶，4℃保存24 h。（3）使用SNaPshot（ABI）試劑盒進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，微測(cè)序引物序列為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTGCATATTGTCCTTCTCCG，反應(yīng)體積為3 μl，其中包括SNaPshot混合液1.5 μl，PCR產(chǎn)物1 μl和微測(cè)序引物0.5 μl。反應(yīng)條件：96℃變性10 s，51℃復(fù)性5 s，60℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。（4）進(jìn)行產(chǎn)物純化，反應(yīng)總體積為5 μl，其中包括：延伸產(chǎn)物3 μl ，SAP（1 U/μl）0.3 μl，ddH2O 1.7 μl，震蕩混勻，37℃孵育1 h，75℃保溫 15 min滅活SAP酶，4℃保存24 h。（5）最后每個(gè)反應(yīng)體系中加入1 μl上述純化延伸產(chǎn)物，與0.2 μl的GenescantTM-120LIZ Size Stangard和8.8 μl去離子甲酰胺混勻后，95℃變性 5 min，再利用ABI公司的ABI13730測(cè)序儀和GeneMapper 4.0軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型?；?/p>

因分型檢出率99.9%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的差異采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)分析對(duì)照組的等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律（HWE）。病例組與對(duì)照組間的等位基因頻率、性別、吸煙、飲酒的分布差異采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算比值比（OR）值及95%可信區(qū)間（CI）。采用Logistic回歸檢驗(yàn)rs4373814位點(diǎn)基因型在病例—對(duì)照組中的分布規(guī)律。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較（表1）

兩組間的年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、飲酒、吸煙差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 CACNB2基因rs4373814等位基因頻率分布的差異

本研究的CACNB2基因位點(diǎn)rs4373814的基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P=0.827），選取樣本具有群體代表性。千人基因組計(jì)劃顯示了不同人群間rs4373814最小等位基因頻率，非洲：0.602，美國(guó)：0.439，歐洲：0.479，東亞：0.535，中國(guó)北京：0.545，中國(guó)南方：0.577。本研究對(duì)照組為0.537，與千人基因組計(jì)劃的東亞和中國(guó)北京最小等位基因符合。CACNB2基因位點(diǎn)rs4373814危險(xiǎn)等位基因C在病例組分布頻率為0.570，病例組分布頻率明顯高于對(duì)照組（0.537），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039，OR=1.068，95%CI：1.004～1.137）。

2.3 不同遺傳模型的rs4373814基因型頻率與高血壓患者的關(guān)聯(lián)分析（表2）

經(jīng)Logistic回歸校正性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒后，發(fā)現(xiàn)顯性模型CC+GC/GG增加高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567）。加性模型CC/GG、GC/GG和隱性模型CC/GC+GG未增加高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)（CC/GG：P=0.031，OR=1.316，95%CI：1.025～1.689；GC/GG： P=0.486，OR=1.075，95%CI：0.878～1.316；CC/GC+GG：P=0.168，OR=1.143，95%CI：0.945～1.382）。

表1 一般臨床資料比較

表2 不同遺傳模型下rs4373814基因型頻率與高血壓患病的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

高血壓是最常見的慢性病，其影響了10%～20%成年人的健康[10]。因此，識(shí)別導(dǎo)致高血壓的基因變異不僅可以提高對(duì)疾病病理生理過(guò)程的理解，也能闡明其生化和生理途徑中涉及的諸多危險(xiǎn)因素[12]。

本試驗(yàn)選取中國(guó)東北（黑龍江省及周邊地區(qū)）漢族人群，進(jìn)行了CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性研究。黑龍江省為我國(guó)高血壓高發(fā)區(qū)，從1958年～2007年5次流行病學(xué)調(diào)查顯示，該地區(qū)高血壓的患病率分別為8.26%、9.65%、11.87%、17.06%和25.69%，患病率始終高于全國(guó)的平均水平，且呈逐年增高的趨勢(shì)[13]。究其原因主要有以下幾個(gè)方面：黑龍江省氣候寒冷，冬季持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，且久居于此的人群大部分有高鹽低鉀、高脂肪和高熱量飲食習(xí)慣，且飲酒、吸煙者比例較高，吸煙、飲酒量也較大。相關(guān)因素分析認(rèn)為高血壓與高血壓家族史、年齡、性別、職業(yè)、吸煙、飲酒、BMI等因素存在多元線性關(guān)系，其中高血壓家族史是其發(fā)病的主要相關(guān)因素[13]。高血壓與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)存在人群異質(zhì)性，因此本試驗(yàn)對(duì)黑龍江省漢族人群進(jìn)行高血壓遺傳基因的研究，對(duì)于驗(yàn)證GWAS的基因變異在不同地區(qū)人群作用具有重要意義。

CACNB2基因位于10p12區(qū)域，共有20個(gè)外顯

子，基因組大小約400 kb，有4個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過(guò)選擇性剪切，總共轉(zhuǎn)錄10多種轉(zhuǎn)錄體。電壓依賴性L型鈣離子通道（Voltage-dependent L-type calcium channel, L-VDDC）包括α1、α2δ和β亞單位，其中β亞基還有4個(gè)亞型（β1、β2、β3、β4）。鈣離子通道β2亞單位主要通過(guò)與α亞基結(jié)合調(diào)節(jié)L-VDDC的電流強(qiáng)度、電壓依賴性、激活與失活特性，從而對(duì)動(dòng)脈血壓的變化形成一定的影響[14]。因此，CACNB2基因位點(diǎn)的變異能夠影響蛋白水平的表達(dá)，從而導(dǎo)致血壓的變化[15]。

本研究較早在中國(guó)北方漢族人群驗(yàn)證CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)北方漢族原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)的高血壓危險(xiǎn)等位基因?yàn)镃，并且在病例組分布頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039，OR=1.068，95%CI：1.004～1.137）。經(jīng)Logistic回歸校正性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒后，進(jìn)行不同遺傳模型的CACNB2基因型分布的差異性分析，僅在顯性模型下發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因基因型CC+GC/GG 顯著增加了高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567），而加性模型和隱性模型下基因型的差異未影響到高血壓的發(fā)病。 Ehret 等[16]對(duì)69 395例歐洲個(gè)體進(jìn)行了Meta分析，結(jié)果同樣顯示CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)與高血壓的易感性密切相關(guān)，危險(xiǎn)等位基因?yàn)镃（P=8.5×10-8）。該結(jié)論與我們的研究結(jié)果相一致， Hong 等[10]在我國(guó)福建省漢族人群中，進(jìn)行了CACNB2基因rs4373814位點(diǎn)與高血壓關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證，結(jié)果顯示，顯性模型下C/G+G/G基因型使高血壓的風(fēng)險(xiǎn)降低（P=0.022，OR=0.70，95%CI：0.51～0.95）。該結(jié)果同樣說(shuō)明rs4373814位點(diǎn)的等位基因C為危險(xiǎn)等位基因，與我們的研究結(jié)果一致。由此可以得出結(jié)論，CACNB2基因rs4373814多態(tài)性與中國(guó)漢族人群原發(fā)性高血壓的易感性存在顯著相關(guān)性，等位基因C可能會(huì)增加漢族人群原發(fā)性高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，我們的研究證實(shí)了CACNB2基因rs4373814的遺傳多態(tài)性與高血壓易感性的顯著關(guān)聯(lián)，為原發(fā)性高血壓的預(yù)防或藥物靶點(diǎn)的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)這也為我們對(duì)原發(fā)性高血壓產(chǎn)生了新的理解，將管理的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向預(yù)防而不是治療。高血壓是遺傳基因與許多致病性增壓因素和生理性減壓因素相互作用而引起的復(fù)雜疾病，單個(gè)基因的單個(gè)位點(diǎn)對(duì)原發(fā)性高血壓的發(fā)病危險(xiǎn)的作用極其微弱。同時(shí)高血壓受到多基因與環(huán)境因素等共同作用，多基因之間與基因—環(huán)境的交互作用則有待于進(jìn)一步研究。因此，我們的研究需要進(jìn)一步在大流行病學(xué)樣本中被驗(yàn)證和進(jìn)行功能學(xué)研究。

[1] Hunt SC, Hasstedt SJ, Kuida H, et al. Genetic heritability and common environmental components of resting and stressed blood pressures, lipids and body mass index in Utah pedigrees and twins. Am J Epidemiol, 1989, 129: 625-638.

[2] Garcia EA, Newhouse S, Caulfield MJ, et al. Genes and hypertension. Curr Pharm Des, 2003, 9: 1679-1689.

[3] Tobin MD, Raleigh SM, Newhouse S, et al. Association of WNKl gene polymorphisms and haplotypes with ambulatory blood pressure in the general population. Circulation, 2005, 112: 3423-3429.

[4] 黨愛民, 陳炳偉. 腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2012, 27: 83-84.

[5] 張瑞巖, 沈衛(wèi)峰. 慢性腎病與心血管疾病. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2004, 19: 234-235.

[6] Levy D, Ehret GB, Rice K, et al. Genome-wide association study of blood pressure and hypertension. Nat Genet, 2009, 41: 677-687.

[7] Natekar A, Olds RL, Lau MW, et al. Elevated blood pressure: Our family’s fault? The genetics of essential hypertension. World J Cardiol, 2014, 6: 327-337.

[8] Marques FZ, Campain AE, Davern PJ, et al. Global identification of the genes and pathways differentially expressed in hypothalamus in early and established neurogenic hypertension. Physiol Genomics, 2011, 43: 766-771.

[9] Takeuchi F, Isono M, Katsuya T, et al. Blood pressure and hypertension are associated with 7 loci in the Japanese population. Circulation, 2010, 121: 2302-2309.

[10] Hong GL, Chen XZ, Liu Y, et al. Genetic variations in MOV10 and CACNB2 are associated with hypertension in a Chinese Han population. Genet MolRes, 2013, 12: 6220-6227.

[11] Sun Q, Wang X, Huang Y, et al. Association between CACNB2 gene polymorphisms and essential hypertension. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 2013, 30: 340-344.

[12] Lin Y, Lai X, Chen B, et al. Genetic variations in CYP17A1, CACNB2 and PLEKHA7 are associated with blood pressure and/or hypertension in She ethnic minority of China. Atherosclerosis, 2011, 219: 709-714.

[13] Cho YS, Go MJ, Kim YJ, et al. A large-scale genome-wide association study of Asian populations uncovers genetic factors influencing eight quantitative traits. Nat Genet, 2009, 41: 527-534.

[14] Fu SY, Li WM, Cao YM, et a1. A 50-year study on the epidemiology of hypertension in Heilongjiang Province of China. Zhonghua Nei Ke Za Zhi, 2009, 48: 375-379.

[15] Antzelevitch C, Pollevick GD, Cordeiro JM, et a1. Loss-of-function mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation, short QT intervals, and sudden cardiac death. Circulation, 2007, 115: 442-449.

[16] Ehret GB, Munroe PB, Rice KM, et al. Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk. Nature, 2011, 478: 103-109.

Association Study Between the rs4373814 Polymorphisms of Calcium Channel Gene and the Susceptibility of Essential Hypertension in Han Population at Northeastern Area of China

ZHANG Hai-ying, SONG Juan-juan, LI Tian-xiao, WANG Yi, LV Xin-peng, ZHOU Hong-bo, DENG Ying.
Department of Emergency, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin （150086）, Heilongjiang, China

Objective: To investigate the relationship between rs4373814 polymorphisms of calcium channel （CACNB2） gene and the susceptibility of essential hypertension （EH） occurrence in Han population at northeastern area of China.

Essential hypertension; Calcium Channel gene; Single nucleotide polymorphism; Association study（Chinese Circulation Journal, 2015,30:661.）

2015-01-04）

（編輯：漆利萍）

黑龍江省自然科學(xué)基金（D201204）

150086 黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科（張海英、宋娟娟、呂信鵬、鄧穎）；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（李天曉、周宏博），生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（王懿）

張海英 碩士研究生 主要從事急危重癥的搶救，中毒的治療等研究 Email: zhanghaiyinggys@163.com 通訊作者：鄧穎

Email：ldlrrr@163.com

R541

A

1000-3614（2015）07-0661-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.012