探討白藜三醇抑制快速電刺激乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及其機(jī)制

葛力萁，李承宗，程明月，張超群，王志榮

探討白藜三醇抑制快速電刺激乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及其機(jī)制

葛力萁，李承宗，程明月，張超群，王志榮

目的：探討白藜三醇（Resveratrol，RSV）對快速刺激乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機(jī)制。

方法：本實(shí)驗(yàn)采用胰酶和膠原酶雙酶法及差速貼壁法分離新生大鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對照組、快速電刺激組（RES組）、快速電刺激+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制劑夾竹桃麻素組（RES+APO組）、快速電刺激+白藜三醇組（RES+RSV組）、快速電刺激+鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑組（RES+AIP組）。為了證實(shí)白藜三醇是否還通過蛋氨酸亞砜還原酶—氧化型鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（MsrA-OXCaMKⅡ）途徑對心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。除了上述5組，另設(shè)了MsrA競爭性阻斷劑0.5%二甲基亞砜（DMSO）對照組（DMSO對照組）和RSV+DMSO組，RES+RSV+DMSO組。細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8（CCK-8）法檢測心肌細(xì)胞活性以確定白藜三醇的最佳濃度，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中AngⅡ水平以選擇最佳心肌細(xì)胞電刺激時(shí)間。流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測心肌細(xì)胞MsrA、NADPH氧化酶4（Nox4）、NADPH氧化酶2（Nox2）、NADPH氧化酶p22phox亞基（P22phox）、OX-CaMKⅡ、凋亡相關(guān)激酶半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-3剪切蛋白表達(dá)。

結(jié)果：（1）與空白對照組比，RES組心肌細(xì)胞AngⅡ分泌顯著增加，同時(shí)Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表達(dá)水平顯著增加。（2）與RES組比，RES+APO組、RES+RSV組和RES+AIP組的活性氧水平降低，RES+RSV組降低更明顯。（3）與RES組比較，RES+APO組、RES+RSV組的Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表達(dá)水平降低，RES+AIP組僅Nox2、OX-CaMKⅡ及Caspase-3剪切蛋白表達(dá)水平降低。（4）加入MsrA抑制劑二甲基亞楓（DMSO）后，白藜三醇抑制快速電刺激導(dǎo)致的Caspase-3剪切蛋白表達(dá)作用減弱。

結(jié)論：白藜三醇對快速電刺激乳鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制NADPH氧化酶及增加MsrA表達(dá)，從而減少乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

白藜三醇；快速電刺激；乳鼠心肌細(xì)胞；NADPH氧化酶；蛋氨酸亞砜還原酶

Methods: The neonatal rats cardiac fibroblasts and myocytes were isolated by double enzyme digestion and differential adhesion method, and the cardiomyocytes were randomly divided into 5 groups: ①Control （CTR） group, ②Rapid electrical stimulation （RES） group, ③RES+APO group, cells were pretreated with NADPH oxidase inhibitor APO, ④RES+RSV group,⑤RES+AIP group, cells were pretreated with CaMKII inhibitor AIP. In order to confirm whether RSV protection was via MsrA-OX-CaMKⅡpathway, the cells were further divided into another 3 groups: ①DMSO control group, ②RSV+DMSO group, ③RES+ RSV+DMSO group. The best dose of RSV was measured with Kit-8 by cardiomyocytes surviving condition, the optimal electrical stimulation time was detected with ELISA by Ang II level in conditioned medium. The level of reactive oxygen species （ROS） in cardiomyocytes was detected by flow cytometry, the protein expressions of MsrA, Nox4, Nox2, P22phox, OX-CaMK II and apoptosis related cleaved caspase-3 were observed by Western blot analysis.

Results:①Compared with CTR group, RES group showed increased AngII secretion with increased protein expressions of Nox4, Nox2, P22phox, OX-CaMK II and cleaved caspase-3. ②Compared with RES group, the RES+APO, RES+RSV, RES+AIP groups had decreased ROS level, the ROS was even lower in RES+RSV group. ③Compared with RES group, the RES+APO, RES+RSV groups presented decreased protein expressions of Nox4, Nox2, P22phox, OXCaMK II and cleaved caspase-3, while RES+AIP group only had decreased Nox2, OX-CaMK II and cleaved caspase-3.④Compared with DMSO control group, RES+ RSV+DMSO group had the lower level of cleaved caspase-3 expression.

Conclusion: RSV has protective effect on rapid electrical stimulation incurred oxidative stress injury in neonatal rats cardiomyocytes, which might be via NADPH oxidase with the increased MsrA expression .

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:684.）

氧化反應(yīng)對機(jī)體很重要，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在的危害。目前對活性氧的具體作用途徑和機(jī)制并不完全明確，但一般清除活性氧，或是下調(diào)過氧化物酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶及一氧化氮解偶聯(lián)，將對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用[1-4]。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKⅡ）在心血管病中起到重要作用，活性氧作用的主要靶蛋白之一。是活性氧使CaMKⅡ轉(zhuǎn)換為氧化型鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（OX-CaMKⅡ），呈持續(xù)的激活狀態(tài)。激活的CaMKⅡ?qū)?dǎo)致心肌細(xì)胞離子通道的改變、興奮收縮偶聯(lián)異常，促進(jìn)活性氧繼續(xù)增加，甚至細(xì)胞凋亡。蛋氨酸亞砜還原酶（MsrA）可以逆轉(zhuǎn)CaMKⅡ氧化，減少對心肌細(xì)胞的損傷[5]。

白藜三醇（RSV）是廣泛存在于植物中的一種活性多酚物質(zhì)。大量研究表明，RSV具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等生物學(xué)特性，發(fā)揮心血管保護(hù)作用[6]。同時(shí)，白藜三醇對Na+、K+離子及鈣瞬變產(chǎn)生影響，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[7]。此外，研究表明，白藜三醇可抑制NADPH氧化酶從而對心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[8]。本研究旨在探討白藜三醇對快速電刺激心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機(jī)制。為證實(shí)白藜三醇除了抑制NADPH氧化酶外，是否還通過MsrA-OXCaMKⅡ途徑對心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，我們加入NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素（APO）及CaMKⅡ抑制劑（AIP）與之相比，進(jìn)一步為研究白藜三醇在心血管疾病方面的治療作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

藥品及試劑：新生SD大鼠來源于徐州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，RSV、APO和AIP均購于美國Sigma公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。細(xì)胞刺激儀購于美國拜譜公司。大鼠血管緊張素-Ⅱ（AngⅡ）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司。鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）、二氨基聯(lián)苯胺顯色劑（DAB）、堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠和山羊抗兔二抗均購于北京中杉金橋科技有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8（CCK-8）試劑盒、活性氧檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。NADPH氧化酶4（Nox4）、NADPH氧化酶2（Nox2）、NADPH氧化酶P22phox亞基（P22phox）抗體購于武漢博士德生物公司。MsrA抗體購于美國Abcam公司。OX-CaMKⅡ抗體購于美國Genetex公司。凋亡相關(guān)激酶半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體購于美國Santa Cruz公司。

心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定：取新生SD大鼠心臟400只，按照文獻(xiàn)[9]的方法獲得原代心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。

快速電刺激模型的制備和分組：心肌細(xì)胞種于6孔板中，培養(yǎng)至第4天置換為無血清培養(yǎng)基，并予以不同藥物處理，NADPH氧化酶抑制劑APO劑量100 μmol/L，AIP的劑量是2 μmol/L。將與6孔板配套的帶有刺激電極的蓋板覆蓋于6孔板上，電極到達(dá)培養(yǎng)基液面以下。蓋板通過導(dǎo)線連接于刺激器，將刺激器頻率設(shè)置為4 HZ。心肌細(xì)胞分為五組：空白對照組（未給予任何干預(yù)）、快速電刺激組（RES組）、RES+APO組、RES+RSV組和RES+AIP組。

為了證實(shí)白藜三醇是否還通過MsrA-OXCaMKⅡ途徑對心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。除了上述5組，另設(shè)了MsrA競爭性阻斷劑0.5%二甲基亞砜（DMSO）對照組（DMSO對照組）、RSV+DMSO組和RES+RSV+DMSO組。

CCK-8檢測心肌細(xì)胞活性以確定白藜三醇的最佳濃度：白藜三醇分5、10、15、20、25 μmol/L五個濃度，將原代心肌細(xì)胞按每孔1×105個細(xì)胞接種于96 孔板。實(shí)驗(yàn)步驟：避光的條件下每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在

37℃，5% CO2的條件下）4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度[10]。

酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中AngⅡ水平：分別取電刺激0.5、1.0、1.5、2.0 h心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA檢測不同時(shí)間段培養(yǎng)基中AngⅡ水平，具體方法參考劑量說明書操作。

流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞活性氧水平：細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，各組加入熒光探針CM-H2DCFDA至終濃度為5 μmol/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。去除培養(yǎng)基，溫磷酸鹽酸緩沖液（PBS，含NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）洗三遍，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的CM-H2DCFDA。消化收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗2遍，PBS液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測活性氧，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光就測得細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[11]。

蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測心肌細(xì)胞MsrA、Nox4、Nox2、P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白、Caspase-3的蛋白表達(dá)。處理后的細(xì)胞用PBS液清洗干凈，用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，14 000×g離心10 min（4℃），收集上清液。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，蛋白高溫變性，加樣，5%的濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行跑膠，轉(zhuǎn)膜，含5%牛血清白蛋白（BSA）緩沖液封閉3 h，一抗4℃孵育過夜。PBS液洗3遍，每次5 min，二抗室溫孵育1.5 h，緩沖液洗凈，顯色，掃描。

2 結(jié)果

2.1 不同白藜三醇濃度組心肌細(xì)胞活性的比較（表1）

CCK-8檢測結(jié)果顯示：與空白對照組相比，白藜三醇25 μmol/L組心肌細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.001），其他4個濃度較空白對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與白藜三醇15 μmol/L組相比，白藜三醇20 μmol/L組心肌細(xì)胞活性降低（P＜0.05），白藜三醇25 μmol/L組心肌細(xì)胞活性也顯著降低（P＜0.001）。因此白藜三醇作用于心肌細(xì)胞的最佳濃度設(shè)定為15 μmol/L。

表1 不同白藜三醇濃度組心肌細(xì)胞活性的比較

表1 不同白藜三醇濃度組心肌細(xì)胞活性的比較

注：與空白對照組相比***P＜0.001；與白藜三醇15 μmol/L組相比△P＜0.05△△△P＜0.001

?

2.2 快速電刺激心肌細(xì)胞對血管緊張素Ⅱ水平的影響

與0.5 h相比，電刺激1.5 h及2 h 的AngⅡ水平明顯增加[（0.256±0.136） vs （0.890±0.099），（0.256±0.136） vs （0.949±0.095）；P均＜0.001]；但在電刺激1.5 h與電刺激2 h AngⅡ水平未見有明顯差異[（0.890±0.099） vs （0.949±0.095），P均＞0.05]，因此，我們選擇刺激心肌細(xì)胞時(shí)間為1.5 h。

2.3 5組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平比較（圖1）

與空白對照組相比，RES組、RES+APO組及RES+AIP組可見心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增高（P均＜0.05），但RES+RSV組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平未見有明顯差異（P＞0.05）；與RES組相比，RES+APO組、RES+RSV組、RES+AIP組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生減少（P均＜0.01）；RES+RSV組活性氧水平低于RES+AIP組（P＜0.05），可見AIP減少活性氧水平的作用較RSV弱；RES+RSV組與RES+APO組活性氧水平未見明顯差異（P＞0.05）。這說明RSV減少活性氧水平的作用較APO和AIP強(qiáng)。

圖1 5組心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的比較（x±s，n=5）

2.4 5組心肌細(xì)胞內(nèi)Nox4、Nox2、P22phox、OXCaMKⅡ蛋白表達(dá)的比較（圖2）

圖2 5組心肌細(xì)胞內(nèi)Nox4、Nox2、P22phox、OX-CaMKⅡ蛋白水平的比較（

與空白對照組相比，RES組Nox4、Nox2、P22phox及OX-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平增加（P均＜0.05）。與RES組相比，RES+APO組和RES+RSV組的Nox4、Nox2、P22phox蛋白表達(dá)水平均下降（P均＜0.05），但兩組間上述三個指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與RES組相比，RES+AIP組只有Nox2、OX-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；此外，RES+RSV組OX-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平低于RES+APO組（P＜0.05），但與RES+AIP組的OX-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 5組心肌細(xì)胞通過上調(diào)MsrA對Caspase-3剪切蛋白和總Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（圖3）

與空白對照組相比，RES組及RES+RSV+DMSO組的Caspase-3剪切蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）、總Caspase-3蛋白表達(dá)減少；與RES組相比，RES+APO組、RES+RSV組、RES+AIP組、DMSO對照組、RSV+DMSO組的Caspase-3剪切蛋白表達(dá)均減少（P＜0.05）、總Caspase-3蛋白表達(dá)增加；與RES+RSV+DMSO組比較，RES+RSV組、DMSO對照組、RSV+DMSO組的Caspase-3剪切蛋白表達(dá)減少（P＜0.01）、總Caspase-3蛋白表達(dá)增加，但RES+APO組、RES+AIP組的Caspase-3剪切蛋白表達(dá)水平與RES+RSV+DMSO組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 白藜三醇通過上調(diào)MsrA對Caspase-3剪切蛋白和總Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短暫的快速電刺激將導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)AngⅡ增加，同時(shí)也伴隨著NADPH氧化酶和活性氧增加，最終導(dǎo)致Caspase-3蛋白表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)白藜三醇可以抑制快速電刺激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞Caspase-3剪切增加，其機(jī)制可能是通過抑制NADPH氧化酶及增加MsrA表達(dá)從而發(fā)

揮對心肌的保護(hù)作用。

越來越多的證據(jù)表明，活性氧的增加將會導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生，如冠狀動脈粥樣硬化、高血壓、心律失常、心力衰竭等[2-4]。大量研究證實(shí)，AngⅡ是導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生的主要因素[12]。CaMKⅡ?qū)儆诮z氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族, 活性氧作用的主要靶蛋白之一。 CaMKⅡ的增加或活性的提高將導(dǎo)致鈣離子平衡失調(diào)和活性氧繼續(xù)增加，導(dǎo)致心力衰竭[13]。CaMKⅡ也存在Ca2+/CaM非依賴性激活，包括磷酸化激活和氧化激活。活性氧誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)使CaMKⅡ調(diào)節(jié)域的甲硫氨酸殘基Met28l/282氧化，轉(zhuǎn)變成OX-CaMKⅡ，CaMKⅡ呈現(xiàn)持續(xù)激活狀態(tài)。CaMKⅡ的氧化主要是通過NADPH氧化酶和線粒體產(chǎn)生的活性氧，NADPH氧化酶通路的基因敲除或是活性氧的清除將減少CaMKⅡ的氧化[14]。MsrA也將使OX-CaMKⅡ可逆，從而減少對心肌的損害和心臟重構(gòu)[15]。

白藜三醇是一種自然的酚類化合物。白藜三醇主要調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生物學(xué)、血小板活性、血管功能、氧化應(yīng)激、炎癥等對心血管產(chǎn)生保護(hù)[16]。其中，抗氧化應(yīng)激主要是通過抑制NADPH氧化酶、增加沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）/叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞家族（FOXO）及核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）依賴性轉(zhuǎn)錄從而減少活性氧產(chǎn)生[17]。

心率的增加將使單位時(shí)間收縮的次數(shù)增加，從而影響細(xì)胞間隙，最終影響傳導(dǎo)速度[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)快速電刺激使單位時(shí)間收縮的次數(shù)增加，致AngⅡ增加和活性氧的增加，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。白藜三醇可以抑制NADPH氧化酶和增加活性氧的清除能力，對心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)。為進(jìn)一步研究白藜三醇的作用機(jī)制，我們加用NADPH氧化酶抑制劑和CaMKⅡ抑制劑組。RES+RSV組及RES+APO組可明顯降低Nox4、Nox2、P22phox蛋白表達(dá)，但RES+AIP組未見有明顯抑制作用。流式細(xì)胞檢測提示RES+RSV組較RES+APO組和RES+AIP組活性氧有明顯降低，提示白藜三醇不僅僅通過抑制NADPH氧化酶減少活性氧產(chǎn)生，還存在其他途徑減少活性氧。白藜三醇可增加MsrA，從而抑制OX-CaMKⅡ，減少活性氧的繼續(xù)產(chǎn)生，減少Caspase-3剪切蛋白表達(dá)，但在加入MsrA抑制劑時(shí)，白藜三醇對抑制心肌Caspase-3剪切蛋白表達(dá)作用消失。白藜三醇通過抑制NADPH氧化酶及增加MsrA蛋白表達(dá)，最終使Caspase-3剪切蛋白表達(dá)減少，抑制氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞損傷。

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Resvertrol Suppressing the Rapid Electrical Stimulation Incurred Oxidative Stress Injury in Neonatal Rats Cardiomyocytes With its Possible Mechanisms

GE Li-qi, LI Cheng-zong, CHENG Ming-yue, ZHANG Chao-qun, WANG Zhi-rong.
Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou （ 221000）, Jiangsu, China

Objective: To explore the protective mechanism of resvertrol （RSV） suppressing the rapid electrical stimulation incurred oxidative stress injury in neonatal rats cardiomyocytes.

Resvertrol; Rapid electrical stimulation; Neonatal rats cardiomyocytes; NADPH oxidase; MsrA

2014-11-26）

（編輯：許 菁）

221000 江蘇省徐州市，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

葛力萁 碩士研究生 主要從事心律失常防治的基礎(chǔ)與臨床研究 Email：woshigeliqi@163.com 通訊作者：王志榮 Email: xzzrw@163.com

R54

A

1000-3614（2015）07-0684-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.017