體內(nèi)藥物分析學(xué)生實(shí)驗(yàn)中藥物血樣測(cè)定方法的優(yōu)選與比較

摘要：本文優(yōu)選了藥學(xué)本科生中有關(guān)體內(nèi)藥物分析的具體實(shí)例，探討了實(shí)驗(yàn)方法的可行性，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化與比較。采用蛋白沉淀法進(jìn)行樣品前處理；紫外檢測(cè)器與熒光檢測(cè)器同時(shí)定量測(cè)定，比較兩種不同檢測(cè)方法的抗干擾能力與信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度的差異，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。與原先設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)相比，本實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)，血藥濃度方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。而且可以使學(xué)生在復(fù)雜樣品測(cè)定方法選擇時(shí)有更好的感性認(rèn)識(shí)、提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，強(qiáng)化所學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的實(shí)際應(yīng)用。為適應(yīng)今后工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；氧氟沙星；體內(nèi)藥分學(xué)生實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：G642.41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2014）48-0275-03

體內(nèi)藥物分析是一門研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)與量的變化規(guī)律的分析方法學(xué)。體內(nèi)藥物分析直接關(guān)系到藥物研制、藥物臨床試驗(yàn)與使用、藥物作用機(jī)制探討、藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)等各階段的工作。它在探求科學(xué)用藥規(guī)律與安全、有效、合理用藥、開發(fā)新藥、保障人類健康方面具有重要作用。

對(duì)體內(nèi)藥物進(jìn)行研究時(shí)，要求分析方法的靈敏度、專屬性和可靠性的程度均較高，建立有效的分析方法是體內(nèi)藥物分析的首要任務(wù)。其次，在新藥研究過程中，按照國(guó)家新藥注冊(cè)審批有關(guān)規(guī)定，要提供藥物在動(dòng)物和人體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)、生物利用度及血漿蛋白結(jié)合率等基本數(shù)據(jù)，這些研究工作要靠體內(nèi)藥物分析來完成。再者，為保證臨床用藥安全有效，體內(nèi)藥物分析也應(yīng)為治療藥物監(jiān)測(cè)提供準(zhǔn)確的血藥濃度測(cè)定值，并對(duì)血藥濃度進(jìn)行具體分析和合理解釋，提供藥學(xué)情報(bào)和信息，參與指導(dǎo)臨床合理用藥確定最佳劑量、制訂治療方案。

建立準(zhǔn)確、可靠的生物樣品分析方法是進(jìn)行體內(nèi)藥物分析的基礎(chǔ)。體內(nèi)樣品大都采樣量少、待測(cè)藥物濃度低、干擾物質(zhì)多，因此體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)是體內(nèi)樣品測(cè)定前須經(jīng)分離與濃集，并且對(duì)定量分析方法的靈敏度和專屬性要求較高。體內(nèi)樣品分析包括兩部分，一部分為前處理方法的選擇和優(yōu)化，包括蛋白沉淀、液液提取、固相萃取等；第二部分為定量測(cè)定方法包括色譜法、免疫分析法等，其中高效液相色譜法因其專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好而在體內(nèi)藥物分析中發(fā)揮著最為重要的作用。

為培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考能力和解決問題的能力，鞏固和加強(qiáng)對(duì)所學(xué)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，我們將原來體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)課程選用的實(shí)驗(yàn)“血漿中水楊酸的HPLC測(cè)定”改為“血漿中氧氟沙星的HPLC法測(cè)定”[1-4]。氧氟沙星具有強(qiáng)的熒光吸收，而水楊酸只有紫外吸收，將水楊酸換成氧氟沙星，同時(shí)采用兩個(gè)檢測(cè)器采集數(shù)據(jù)，根據(jù)兩種檢測(cè)器中的樣品出峰情況，學(xué)生可以直觀地對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行專屬性和靈敏度的比較，鞏固課堂上關(guān)于藥物結(jié)構(gòu)與分析方法選擇的相關(guān)知識(shí)。為學(xué)生今后科研工作提供有益參考，對(duì)于提高學(xué)生的藥學(xué)專業(yè)素質(zhì)有著至關(guān)重要的作用。

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.實(shí)驗(yàn)藥物：氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，氧氟沙星膠囊。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性大鼠，體重250g左右，由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

3.實(shí)驗(yàn)方法。①給藥方案：按80mg/kg劑量一次性大鼠灌胃氧氟沙星，灌胃后1.5小時(shí)取大鼠血樣于預(yù)加肝素試管中，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層血漿于試管中，-18℃冰箱冷凍保存。②儀器條件：日本HITACHI公司L-2000型高效液相色譜儀，含四元泵（L-2130）、柱溫箱（L-2300）、自動(dòng)進(jìn)樣器（L-2200）、二極管陣列檢測(cè)器（L-2455）和D-2000工作站。色譜分析條件：色譜柱：C18柱，200mm×4.6mm（ID），5m。柱溫：30℃。流動(dòng)相：0.5%三氟乙酸水溶液：甲醇=60：40；紫外檢測(cè)：檢測(cè)波長(zhǎng)296nm；熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)296nm，發(fā)射波長(zhǎng)498nm；流速：1.0mL/min③氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品5.16mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，藥物濃度為0.509mg/mL（標(biāo)準(zhǔn)品含量98.6%），作為貯備溶液。精密量取貯備溶液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為508.8μg/mL、50.88μg/mL和5.09μg/mL的溶液。④血樣處理：精密移取血漿0.2ml，置1.5ml塑料離心管內(nèi)，加入10%高氯酸溶液0.1mL，旋渦2min后，16000rpm離心10min，取上清液20l進(jìn)樣作HPLC分析。外標(biāo)法定量。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.專屬性考察。在此色譜條件下，氧氟沙星與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)均完全分離，峰形尖銳，其保留時(shí)間約為4.2分鐘，其他均為內(nèi)源性雜質(zhì)?？疾炝?份不同來源的大鼠血漿，在所建立的HPLC條件下進(jìn)行分析，典型色譜圖如圖1～2。其中圖1為空白血漿色譜圖，圖2為含藥血漿色譜圖，圖中a為熒光檢測(cè)器信號(hào)；b為紫外檢測(cè)器信號(hào)。從圖中可以看出紫外檢測(cè)器中雜峰明顯偏大，而且在藥物信號(hào)窗附近有干擾；熒光檢測(cè)器時(shí)血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾并且氧氟沙星的色譜峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫外檢測(cè)器中的響應(yīng)。

2.熒光檢測(cè)器檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍。取若干只1.5mL塑料離心管，各加入空白血漿0.5mL，加入氧氟沙星對(duì)照品溶液，使其濃度分別為0.020、0.051、0.102、0.204、0.509、1.018、2.036、5.088和

10.176μg/mL，每個(gè)濃度三管，再按“血樣預(yù)處理”項(xiàng)的方法操作后，作HPLC分析。以樣品峰面積（Y），對(duì)藥物濃度（C，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算結(jié)果為Y=820.5506C-73.2914（r=0.9992，n=9）。線性范圍：0.0210μg/ml。

3.精密度。配制高、中、低三個(gè)點(diǎn)（0.05、0.5和5μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)血樣各6份，于同一天按血樣預(yù)處理的方法操作后進(jìn)樣20μL，作HPLC分析，計(jì)算批內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定三批樣品作批間精密度試驗(yàn)。結(jié)果為低、中、高濃度的天內(nèi)精密度RSD分別為5.53%、2.25%及1.17%。批間精密度RSD分別為5.22%、3.28%及1.91%。endprint

4.方法回收率。取大鼠空白血0.5mL若干，分別加入氧氟沙星對(duì)照品溶液，使其濃度分別為0.05、0.5和5g/mL，再按“血樣預(yù)處理”項(xiàng)的方法操作后，作HPLC分析。將藥物峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程中，計(jì)算所得的濃度除以理論濃度，即得方法回收率，結(jié)果分別為103.96±4.16%、100.58±1.91%及100.02±1.16%。

5.提取回收率。取大鼠空白血漿0.5ml數(shù)份，分別加入氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液使血漿中氧氟沙星的濃度分別為0.05、0.5和5μg/mL，同法用水代替血漿制備三個(gè)濃度樣品，每個(gè)濃度做三份，按血樣預(yù)處理后作HPLC分析，記錄峰面積。計(jì)算提取回收率。結(jié)果分別為88.75%±1.58、93.92%±6.37及91.70%±2.01。

6.定量限。取大鼠空白血漿0.5mL，精密加入氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其濃度為0.01μg/mL，再按“血樣預(yù)處理”項(xiàng)的方法操作后，進(jìn)樣20μL，血樣最低定量濃度熒光檢測(cè)器為0.02μg/mL、紫外檢測(cè)器為0.2μg/mL。

三、討論

1.樣品預(yù)處理方法的選擇。本實(shí)驗(yàn)的樣品預(yù)處理方法為沉淀蛋白法，操作極為簡(jiǎn)單，引入誤差小，樣品的取用量少。而原先樣品預(yù)處理方法為有機(jī)溶劑提取法，方法操作煩瑣，在處理過程中樣品容易發(fā)生乳化而導(dǎo)致樣品損失；另外采用液液提取法血漿樣品取用量大，實(shí)際操作性差，同時(shí)實(shí)驗(yàn)成本較高。

2.測(cè)定方法的選擇。本實(shí)驗(yàn)中我們開發(fā)了測(cè)定大鼠血漿中氧氟沙星的高效液相色譜測(cè)定方法，該方法靈敏、專屬、準(zhǔn)確性高，血藥濃度測(cè)定準(zhǔn)確。選擇具有紫外及熒光吸收的藥物進(jìn)行HPLC分離后熒光與紫外同時(shí)檢測(cè)，通過兩種檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果比較，使學(xué)生掌握以藥物結(jié)構(gòu)為依據(jù)進(jìn)行定量方法選擇這一重要思路，為學(xué)生今后科研工作提供有益參考。

經(jīng)本校多個(gè)年級(jí)本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)證明，該實(shí)驗(yàn)方法操作性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單直觀、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了學(xué)生對(duì)教學(xué)內(nèi)容的認(rèn)識(shí)，達(dá)到了較好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的。

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作者簡(jiǎn)介：梁建英，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，藥物分析學(xué)教研室。endprint