電化學(xué)生物傳感器在microRNA檢測(cè)中的應(yīng)用

馬雯 呂微風(fēng) 鄭磊

·綜述·

電化學(xué)生物傳感器在microRNA檢測(cè)中的應(yīng)用

馬雯 呂微風(fēng) 鄭磊★

M icroRNA（m iRNA）是一種內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，參與細(xì)胞的增殖凋亡分化和代謝等重要生理過(guò)程。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA能夠耐受RNA酶消化、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、煮沸等極端條件，是一種潛在的疾病標(biāo)志物。因此，miRNA的檢測(cè)對(duì)疾病的早期診斷具有重要的生物學(xué)意義。電化學(xué)生物傳感器由于其簡(jiǎn)易、便攜、靈敏、反應(yīng)快速以及價(jià)格低廉等特點(diǎn)而被研究者廣泛應(yīng)用于m iRNA檢測(cè)的研究。本文綜述了m iRNA的電化學(xué)傳感器的研究進(jìn)展，評(píng)述了各類方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)m iRNA電化學(xué)檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

m icroRNA（m iRNA）；生物標(biāo)志物；電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是一門有關(guān)化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)以及電子學(xué)等領(lǐng)域的交叉學(xué)科，它具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、成本低、可進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。其工作原理是：當(dāng)待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入敏感元件后，與敏感元件生物體成分（酶、激素、抗原、抗體、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器等）特異性結(jié)合，發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，所產(chǎn)生的信息通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換元件（固體電極、氣敏電極、離子選擇性電極等）以轉(zhuǎn)換為定量處理的電信號(hào)，再經(jīng)電子測(cè)量?jī)x的放大、處理和輸出，即可達(dá)到分析檢測(cè)的目的。

1 miRNA

1993年，人類首次在秀麗新桿狀線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)

lin-4，隨后又有研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)m iRNA廣泛地存在哺乳動(dòng)物、果蠅和植物等生物中［1］。目前已有研究證明，miRNA參與生命過(guò)程中的一系列重要活動(dòng)，包括生長(zhǎng)發(fā)育、免疫防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝、腫瘤發(fā)展、心臟發(fā)生等［2］。雖然目前對(duì)已發(fā)現(xiàn)的m iRNA分子功能和作用靶基因的研究還處于初步階段，但是從miRNA在不同組織和疾病中的表達(dá)譜中分析發(fā)現(xiàn)，某些miRNA在特定疾病表達(dá)譜中具有明顯的組織特異性［3－5］。以上研究均表明，m iRNA在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在非常重要的作用。

2008年，Law rie［6］等在人類血清中首次檢測(cè)到miRNA，并發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血清m iR-21表達(dá)上調(diào)。從此，不少學(xué)者將研究方向轉(zhuǎn)到血清和血漿中來(lái)。最近幾年，相繼在乳腺癌、白血病、心肌梗死、肝炎［7－10］等疾病患者中發(fā)現(xiàn)循環(huán)m iRNA表達(dá)量與正常人相比具有明顯差異，且在某些疾病中還可用于診斷、分期和預(yù)后檢測(cè)。另還有報(bào)道證明循環(huán)m iRNA可耐受一些苛刻的環(huán)境，如多次反復(fù)凍融，強(qiáng)酸強(qiáng)堿、長(zhǎng)期保存甚至煮沸［11］。這些研究均證實(shí)了m iRNA在血中十分穩(wěn)定。目前關(guān)于血清和血漿樣品中m iRNA穩(wěn)定性的機(jī)制雖然還沒(méi)有定論，但是已發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可與一些蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，如Argonaute2（Ago2）、核仁磷酸蛋白（nucleophosm in，NPM）、低密度脂蛋白（low densith lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），也可以包含于微囊泡（microvesicle）、外泌體（exosome）、凋亡小體（apoptosis body）等，這些特性均可為其穩(wěn)定性提供基礎(chǔ)［12－13］。

循環(huán)miRNA的發(fā)現(xiàn)是臨床分子生物學(xué)革命性的突破，其高度的特異性和穩(wěn)定性決定了其作為一種新的疾病生物標(biāo)志物的巨大潛力。因此，找到一種適合的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

1.1 miRNA檢測(cè)的難點(diǎn)

（1）m iRNA成熟體只有20多個(gè)bp，降解溫度低，故miRNA提取后保存要求較高。（2）同一家族miRNA堿基組成區(qū)別不大，有的甚至只有1個(gè)堿基的區(qū)別。（3）m iRNA合成過(guò)程中，由于存在pri-m iRNA、pre-m iRNA、m iRNA成熟體，在檢測(cè)miRNA成熟體時(shí)必須排除其他2種形式的miRNA干擾。（4）miRNA在人體內(nèi)含量一般較低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求相對(duì)較高［14］。

1.2 目前常用的檢測(cè)方法

目前常用的m iRNA檢測(cè)技術(shù)包括Northern印跡雜交（northern blotting）、微陣列芯片（m icroarray）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）等。Northern blotting一般先用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出特定m iRNA，然后利用雜交原理與印跡膜上修飾的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)而分析靶m iRNA的含量。但是此方法由于其樣品需求量大、靈敏度低、不適合高通量分析等特點(diǎn)而并不適用于臨床［15］。微陣列芯片又稱基因芯片，其可對(duì)m iRNA實(shí)行高通量、多組分檢測(cè)。可這種方法相對(duì)費(fèi)用較高，且存在背景及其他信號(hào)干擾導(dǎo)致重復(fù)性差，一般只用于初篩，所得結(jié)果最終還需實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證［16］。目前臨床和科研中最常使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)進(jìn)行m iRNA的檢測(cè)，此方法將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，從而大大提高檢測(cè)能力。但是這種技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件以及實(shí)驗(yàn)操作者要求較高，且檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較貴。此外，還有研究者利用表面增強(qiáng)拉曼、生物發(fā)光、原位雜交、納米孔技術(shù)來(lái)檢測(cè)m iRNA，但是這些方法一般需要特殊儀器，不利于臨床大規(guī)模開(kāi)展。若發(fā)展一種適用于臨床實(shí)驗(yàn)室的m iRNA檢測(cè)方法，應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)要求：（1）應(yīng)具備敏感的檢測(cè)能力，能定量敏感檢測(cè)出不同臨床標(biāo)本甚至極低豐度的m iRNA；（2）應(yīng)具備良好的特異性，能區(qū)分出高度同源的m iRNA；（3）檢測(cè)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便，無(wú)需昂貴的設(shè)備和試劑。電化學(xué)生物傳感器由于其簡(jiǎn)易、便攜、靈敏、反應(yīng)快速以及價(jià)格低廉等特點(diǎn)而被研究者廣泛應(yīng)用于m iRNA檢測(cè)的研究?，F(xiàn)就m iRNA電化學(xué)檢測(cè)新技術(shù)作一綜述。

2 miRNA電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

一個(gè)典型的m iRNA生物傳感器設(shè)計(jì)原理是將識(shí)別元件固定在載體表面，加入可指示雜交信號(hào)的電活性物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)電極在待測(cè)溶液中電化學(xué)信號(hào)的變化，以確定靶m iRNA的濃度。特異性和敏感性是評(píng)價(jià)m iRNA生物傳感器的2個(gè)至關(guān)重要的因素。特異性主要由識(shí)別元件（一般為捕獲探針）來(lái)決定，敏感性則主要由信號(hào)放大技術(shù)決定。

2.1 捕獲探針設(shè)計(jì)

所有的miRNA電化學(xué)傳感器檢測(cè)方法均存在1個(gè)雜交的過(guò)程，因此捕獲探針的設(shè)計(jì)顯得尤為重要。由于m iRNA的序列較短，所以捕獲探針在設(shè)計(jì)上難度較大。目前常用的是線性寡聚DNA探針、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針、DNA納米結(jié)構(gòu)的探針。

2.1.1 普通線型探針

一維線型探針合成簡(jiǎn)單，線性單鏈DNA探針?lè)肿幼鳛樽R(shí)別元件非特異結(jié)合較多，配對(duì)堿基間結(jié)合力弱，無(wú)法鑒別單個(gè)堿基錯(cuò)配，檢測(cè)特異性及靈敏度不高［17］。但是又有文獻(xiàn)［18］報(bào)道可以通過(guò)提高雜交溫度來(lái)消除堿基錯(cuò)配的影響。在37℃時(shí)，線性探針無(wú)法消除錯(cuò)配的影響，但當(dāng)雜交溫度達(dá)到65℃時(shí)，單堿基錯(cuò)配的電流信號(hào)接近背景值［19］。

2.1.2 分子信標(biāo)探針

分子信標(biāo)探針是一種可在核酸5′和3′端自身形成的具有莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其環(huán)狀部分與目標(biāo)序列互補(bǔ)，一般為15～30個(gè)堿基。其莖干區(qū)的堿基數(shù)一般為環(huán)狀區(qū)的一半，過(guò)長(zhǎng)，靈敏度下降；過(guò)短，則穩(wěn)定性下降。由于分子信標(biāo)雜交前后環(huán)狀區(qū)與靶分子的雙鏈結(jié)構(gòu)之間存在著熱力學(xué)平衡關(guān)系，它的雜交特異性明顯高于常見(jiàn)的線狀探針，是目前應(yīng)用最廣的捕獲探針。

2.1.3 DNA納米結(jié)構(gòu)探針

傳統(tǒng)的DNA探針通常為一維（單鏈探針）或二維（莖環(huán)狀探針）結(jié)構(gòu)，傳感界面在制備過(guò)程中均一性極難得到有效的控制，從而影響了實(shí)際樣品檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性。三維DNA探針因其高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和剛性的特點(diǎn)，可以有效提高DNA探針表面分布排列的均一性，精確調(diào)控探針之間的距離，因而顯著提高了生物檢測(cè)的靈敏度和特異性，這一研究結(jié)果顯示了DNA納米技術(shù)作為新型生物傳感平臺(tái)的巨大潛力［20］。將DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針組裝到電化學(xué)裝置的工作電極表面，使目標(biāo)m iRNA與工作電極表面DNA三維納米結(jié)構(gòu)探針雜交，隨后加入氧化還原酶和相應(yīng)的底物使用電化學(xué)裝置進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)（圖1）。該方法檢測(cè)限低至10 aM，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)需要大量檢測(cè)樣品的難點(diǎn)［21］。另外，該檢測(cè)方法的特異選擇性強(qiáng)，能夠很好區(qū)分同族的m iRNA的堿基錯(cuò)配，與傳統(tǒng)探針相比，本方法穩(wěn)定性更高。

圖1 捕獲探針為四面體結(jié)構(gòu)的的酶促生物傳感器檢測(cè)示意圖［21］Figure 1 Scheme of strategy for am iRNA enzyme biosensor based on tetrahedral probes［21］

2.1.4 其他

識(shí)別元件的取代基類型決定了其與靶物質(zhì)的結(jié)合親和力及穩(wěn)定性。目前應(yīng)用于傳感器識(shí)別元件的核酸寡聚體除了傳統(tǒng)的DNA、RNA之外，還有RNA的核酸模擬物（locked nucleic acid，LNA）及DNA的核酸模擬物肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）。鎖核酸（LNA）［22］是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)2′-O、4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體，核糖的2′-O位和4′-C位通過(guò)不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。與其他寡核苷酸相比，LNA有如下優(yōu)勢(shì)［23］：（1）和DNA、RNA互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性；（2）抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性；（3）LNA-DNA雜交物能激活RNaseH；（4）水溶性好，自由穿入細(xì)胞膜，易被機(jī)體吸收；（5）體內(nèi)無(wú)毒性作用。基于以上這些優(yōu)點(diǎn)，大量基于LNA探針的m iRNA檢測(cè)方法被大量開(kāi)發(fā)。肽核酸（PNA）是一種人工合成的具有類多肽骨架的DNA類似物，其有如下特點(diǎn)：（1）骨架呈電中性，與靶序列雜交時(shí)不受靜電排斥作用的影響；（2）雜交活性幾乎不受介質(zhì)鹽濃度的影響；（3）PNA／RNA雜交比DNA／RNA雜交更易受堿基錯(cuò)配影響；（4）體內(nèi)無(wú)毒性作用［24］。目前已有研究將PNA作為檢測(cè)探針與氧化石墨烯結(jié)合成功實(shí)現(xiàn)在胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種m iRNA，并論證了PNA用于m iRNA檢測(cè)的優(yōu)越性［25］（圖2）。

圖2 基于PNA-NGO復(fù)合物的m iRNA生物傳感器檢測(cè)示意圖［25］Figure 2 Scheme of strategy for am iRNA sensor based on NGO and PNA［25］

2.2 信號(hào)放大技術(shù)

由于m iRNA在體內(nèi)含量極少且本身序列較短，產(chǎn)生的信號(hào)很難與背景信號(hào)進(jìn)行區(qū)分，所以需要使用信號(hào)放大技術(shù)將信號(hào)進(jìn)行放大，使檢測(cè)信號(hào)與背景信號(hào)很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。目前，電化學(xué)傳感器常用的信號(hào)放大技術(shù)有納米材料放大技術(shù)、酶催化信號(hào)放大、電活性物質(zhì)放大技術(shù)、鳥(niǎo)嘌呤氧化放大技術(shù)等。

納米材料以其獨(dú)特的化學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)等性質(zhì)引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。隨著納米材料研究的不斷深入，越來(lái)越多具有良好電化學(xué)性能的納米材料應(yīng)用于傳感器電極的構(gòu)建。圖3［26］顯示了基于納米結(jié)構(gòu)的微電極陣列電導(dǎo)率的變化來(lái)檢測(cè)單層的電荷中性的嗎啉代寡核苷酸與靶m iRNA的雜交過(guò)程，將一個(gè)親生物界面的單層的電荷中性的嗎啉代寡核苷酸固定在硅烷活化的銦錫氧化物電極上，與靶m iRNA雜交使生物傳感器表面形成高密度的負(fù)電荷。二甲氧基聯(lián)苯胺、辣根過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫的引入使得在生物傳感器表面產(chǎn)生多聚二甲氧基聯(lián)苯胺復(fù)合物膜，該復(fù)合物膜的電導(dǎo)率與m iRNA量呈正比。該方法已在溶液中成功檢測(cè)let-7c，檢測(cè)限為2fM，且能成功鑒別單堿基錯(cuò)配。但使用臨床血標(biāo)本直接檢測(cè)時(shí)，變異較大，可能是血清中的高蛋白及其他血液成分嚴(yán)重影響m iRNA的測(cè)量。研究者又利用硅納米線場(chǎng)效應(yīng)管構(gòu)成CMOS反相器在肺癌細(xì)胞和人類血清中成功檢測(cè)m iRNA（圖4）［27］。這種新型的生物傳感器首先利用半導(dǎo)體技術(shù)在加工的硅納米線上固定單鏈DNA探針，當(dāng)靶m iRNA附著在硅納米線表面，與DNA探針雜交后，負(fù)電荷增加引起電流變化。該傳感器檢測(cè)限達(dá)到1zM，并成功檢測(cè)肺癌細(xì)胞以及人類血清中的m iRNA。然而，該傳感器的性能易受到工藝偏差的影響。另外，納米器件本身需要在較低的電壓下工作，這將導(dǎo)致器件噪聲容限的降低。所以，該傳感器將來(lái)要運(yùn)用于臨床，還需進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 基于納米結(jié)構(gòu)的微電極陣列電導(dǎo)率的變化來(lái)檢測(cè)靶m iRNA的生物傳感器示意圖［26］Figure 3 Scheme of strategy for a miRNA biosensor based on change of the conductivity of nanom icroelectrode array［26］

圖4 硅納米線場(chǎng)效應(yīng)管構(gòu)成CMOS反相器檢測(cè)m iRNA示意圖［27］Figure 4 Scheme of strategy for am iRNAbiosensor based onCMOS-compatible silicon nanow ire field-effecttransistors［27］

目前也有許多方法是利用納米材料標(biāo)記來(lái)進(jìn)行信號(hào)放大［28］（圖5）。該方法先將分子信標(biāo)捕獲探針固定在金電極上，當(dāng)靶物質(zhì)與捕獲探針互補(bǔ)雜交時(shí)，分子信標(biāo)莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，納米銀標(biāo)記的寡核苷酸探針隨之與捕獲探針結(jié)合。納米銀在堿性條件下可催化H2O2還原，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。H2O2產(chǎn)生的電化學(xué)響應(yīng)值與m iRNA數(shù)量呈正相關(guān)。該電化學(xué)傳感器的檢測(cè)限達(dá)到67fM。但該方法需要對(duì)探針預(yù)先進(jìn)行標(biāo)記，操作較為復(fù)雜且相對(duì)成本較高。

圖5 納米銀標(biāo)記寡核苷酸探針?lè)糯髾z測(cè)miRNA示意圖［28］Figure 5 Scheme of strategy for a miRNA biosensor based on oligonucleotide encapsulated silver nanoclusters as probes［28］

酶由于其對(duì)相應(yīng)的底物具有催化轉(zhuǎn)化能力和特異選擇作用而被廣泛應(yīng)用于各類化學(xué)分析上。電化學(xué)酶基因傳感器的原理為利用酶對(duì)底物的催化，使底物氧化或還原，產(chǎn)生可在電極上進(jìn)行反應(yīng)的物質(zhì)，獲得電流信號(hào)。例如，將生物素標(biāo)記的捕獲探針綁定在親和素包被的納米磁珠上，當(dāng)探針遇到生物素化的靶m iRNA時(shí)發(fā)生雜交，此時(shí)鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶就可連接到磁珠上，通過(guò)對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，從而對(duì)miRNA進(jìn)行定量［29］。該方法成功用于檢測(cè)細(xì)胞中m iRNA的表達(dá)情況，其靈敏度達(dá)到7 pM。隨后，又有研究者將捕獲探針固定在納米金修飾的大電極上，在靶物質(zhì)存在下，石墨烯－血紅素復(fù)合物（具有類過(guò)氧化物酶催化活性）可連接到體系中，從而對(duì)miRNA進(jìn)行定量［30］（圖6）。該傳感器由于石墨烯組分的引入增強(qiáng)了血紅素本身的催化活性，具有協(xié)同作用，使其檢測(cè)限達(dá)到0.17 pM，并且成功用于擬南芥幼苗中m iRNA的檢測(cè)。為了得到更高的靈敏度，有學(xué)者又利用四面體納米探針作為捕獲探針，在靶miRNA存在的條件下與生物素標(biāo)記的2條輔助探針一起形成雜交連鎖反應(yīng)，隨后加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，催化H2O2，產(chǎn)生電信號(hào)［31］。該方法檢測(cè)限達(dá)到10 aM。但是稍顯不足的是，該體系并未用于檢測(cè)任何臨床標(biāo)本。這種利用2條輔助探針形成雜交連鎖結(jié)構(gòu)的體系還需在臨床樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 模擬酶催化系統(tǒng)電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)m iRNA示意圖［30］Figure 6 Scheme of strategy for amiRNA biosensor based on mimic enzyme catalysis system［30］

近年來(lái)，不少研究者開(kāi)發(fā)了一系列基于電活性物質(zhì)直接標(biāo)記檢測(cè)m iRNA的方法。例如，將具有氧化還原活性和電催化活性的物質(zhì)Ru（PD）2Cl2通過(guò)與m iRNA上嘌呤堿基的配位作用連接到m iRNA上，催化肼的氧化，檢測(cè)限可以到200 fM［32］。雖然檢測(cè)限相比其他方法不是很有優(yōu)勢(shì)，但是該方法樣品用量很少，并且僅需10 ng的總RNA就能定量m iRNA。但是該方法需要對(duì)靶m iRNA進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記，操作較為復(fù)雜耗時(shí)，不適合臨床廣泛使用。為了提高靈敏度，有研究者利用［Ru（NH3）6］3＋能夠結(jié)合帶陰性電荷的DNA雙鏈作為指示劑的特點(diǎn)，提出了一種定量檢測(cè)m iRNA的方法［33］（圖7）。在靶物質(zhì)存在的情況下，可發(fā)生雜交連鎖反應(yīng)，形成長(zhǎng)的雙鏈片段。［Ru（NH3）6］3＋直接結(jié)合雙鏈片段，進(jìn)而被連接到電極上，產(chǎn)生放大電流信號(hào)。該方法檢測(cè)限達(dá)到100 aM，并成功用于血液標(biāo)本的檢測(cè)。

由于m iRNA在體內(nèi)含量極低，需要極為靈敏的方法進(jìn)行檢測(cè)，所以研究人員一般更傾向于多種放大技術(shù)聯(lián)用達(dá)到多重放大的效果。在固定電極上利用納米與酶雙重放大技術(shù)成功檢測(cè)了細(xì)胞中的m iR-21的含量（圖8）［34］，該傳感器檢測(cè)限達(dá)到0.06pM。另外，還有研究者利用3-氨基苯酚硼酸（3-am ino phenol boric acid，APBA）與具有順式二醇結(jié)構(gòu)的核糖核酸特異性結(jié)合形成酯鍵的功能成功的將m iRNA與單鏈DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)［35］。該傳感器使用了修飾了APBA和生物素的納米金，

與生物素特異結(jié)合的親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶，可使催化產(chǎn)物進(jìn)行氧化還原循環(huán)的三（2-氯乙基）磷酸酯（Tris（2-chloroethyl）phosphate，TCEP），從而實(shí)現(xiàn)三重放大。經(jīng)三重放大后，該傳感器檢測(cè)限達(dá)到3 fM。但是該傳感器目前只在溶液中檢測(cè)了miR-21，并未在臨床樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。雖然多重放大有利于提高傳感器靈敏度，但操作較為復(fù)雜耗時(shí)，且批間差異較大，不適合臨床廣泛使用。

圖7 電活性物質(zhì)直接標(biāo)記檢測(cè)miRNA示意圖［33］Figure 7 Scheme of strategy for a m iRNA biosensor based on the electroactivematerials［33］

圖8 雙重信號(hào)放大系統(tǒng)聯(lián)合聯(lián)測(cè)miRNA示意圖［34］Figure 8 Scheme of strategy for amiRNA biosensor based on dual signal amplifier system［34］

2.3 電化學(xué)傳感器新思路

目前，電化學(xué)傳感技術(shù)所構(gòu)造的體系一般是用捕獲探針將靶miRNA捕獲后，在后期通過(guò)利用納米材料、酶、電活性物質(zhì)等進(jìn)行一系列的信號(hào)放大，從而提高其靈敏度，實(shí)現(xiàn)m iRNA的檢測(cè)。在此過(guò)程中一般不涉及m iRNA的數(shù)量擴(kuò)增。目前又有一些新的檢測(cè)miRNA方案被逐漸提出。在2012年，Yin［36］等利用雙鏈特異性核酸酶進(jìn)行一步反應(yīng)成功檢測(cè)了m iRNA（圖9）。當(dāng)靶m iRNA與DNA探針結(jié)合后，此種核酸酶能特異性水解DNA-m iRNA雜交鏈中的DNA鏈，而m iRNA保持完整，進(jìn)而可以與另一條DNA探針結(jié)合，此過(guò)程不斷進(jìn)行進(jìn)行，從而增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，其檢測(cè)限達(dá)到100 fM。而Jia等［37］則通過(guò)設(shè)計(jì)一段兩端相同，中間含有切刻酶酶切位點(diǎn)的探針作為擴(kuò)增模板，利用m iRNA3′端可以作為DNA引物的特點(diǎn)，在聚合酶的作用下形成雙鏈產(chǎn)物。生成的雙鏈產(chǎn)物在切刻酶酶切位點(diǎn)處切刻，產(chǎn)生新的羥基端繼續(xù)引發(fā)聚合反應(yīng)。被切刻下來(lái)的序列與探針3′端完全互補(bǔ)，又可以引發(fā)新的聚合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)m iRNA的超敏檢測(cè)，其檢測(cè)限甚至達(dá)到1zM。基于此，未來(lái)m iRNA電化學(xué)生物傳感器或許可以引入等溫?cái)U(kuò)增的概念，與其他技術(shù)結(jié)合，從數(shù)量擴(kuò)增以及信號(hào)放大兩方面增加傳感器的靈敏度，實(shí)現(xiàn)床旁檢測(cè)（pointof care testing，POCT）。

圖9 基于DNSNA酶等溫?cái)U(kuò)增直接檢測(cè)miRNA示意圖［36］Figure 9 Scheme of strategy for a m iRNA biosensor based on Duplex-Specific nuclease signal amplification（DSNSA）［36］

3 展望

血液循環(huán)中存在與疾病相關(guān)的m iRNA，并且可以耐受RNA酶的破壞而穩(wěn)定地存在。目前對(duì)循環(huán)miRNA的研究還處于初步階段，許多重要的問(wèn)題急待解決，如研究的病種范圍還非常有限、檢測(cè)的樣本數(shù)較?。ㄍǔH有幾十例）、檢測(cè)方法繁瑣且價(jià)格昂貴等，這些問(wèn)題都將限制其進(jìn)入臨床應(yīng)用。相信隨著對(duì)m iRNA研究的深入及檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，循環(huán)m iRNA的檢測(cè)最終將能應(yīng)用于臨床，為疾病無(wú)創(chuàng)診斷、治療和預(yù)后提供新依據(jù)。如何進(jìn)一步提高方法的靈敏度、減少操作的煩瑣程度、縮短實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間以及降低實(shí)驗(yàn)的成本，是各種檢測(cè)方法的最終追求目標(biāo)。電化學(xué)生物傳感器

因其制作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、成本低、易于實(shí)現(xiàn)微型化等諸多優(yōu)點(diǎn)得到研究者的廣泛青睞。未來(lái)電化學(xué)miRNA生物傳感器的研究熱點(diǎn)將集中在：（1）傳感器設(shè)計(jì)的的優(yōu)化：尋求更好的納米材料進(jìn)行電極的修飾，更穩(wěn)定的探針固定方法及更優(yōu)良的雜交指示劑；（2）增加靈敏度：從數(shù)量擴(kuò)增以及信號(hào)放大兩方面增加靈敏度；（3）多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)：一個(gè)儀器同時(shí)測(cè)量多種靶m iRNA，同時(shí)避免相互干擾；（4）微型化：實(shí)現(xiàn)POCT，使此類產(chǎn)品滲透到人類的生活中去。

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App lications of electrochem ical biosensors in the detection ofm icroRNA

MA Wen,LV Weifeng,ZHENG Lei★
(Department of Laboratory Medicine,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong, China,510515)

M icroRNAs(miRNAs)are a class of short endogenous non-coding RNAs that involve in diverse biological processes of cells,including development,differentiation,proliferation,and apoptosis.In recent years,accumulating studies have shown that the circulating m iRNAs are resistant to RNase digestion, extreme pH and temperature,and have been proposed as novel biomarkers in diagnostics.The detection of miRNA is of great biological significance for clinical diagnosis.Ow ing to the fact that electrochem ical detector is simple,portable,sensitive,fast response and low cost,electrochemical biosensors have been recognized to be the most promising way for miRNA detection.In this paper,the progress of miRNA electrochemical biosensor is summarized.And the advantages and the disadvantages of all kinds of methods and prospect them iRNA electrochem ical detection trends are reviewed.

M icroRNA(miRNA)；Biomarker；Electrochemical biosensors

國(guó)家自然科學(xué)基金（81371901）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20134433110010）；廣東省科技計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目（2012B050600021）

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東，廣州510515

★通訊作者：鄭磊，E-mail：nfyyzl＠163.com