兩例短串聯(lián)重復(fù)序列三帶型等位基因的遺傳多態(tài)性分析

許澤輝嚴(yán)提珍羅世強(qiáng)王秋華唐寧★

·論著·

兩例短串聯(lián)重復(fù)序列三帶型等位基因的遺傳多態(tài)性分析

許澤輝1，2嚴(yán)提珍1，2羅世強(qiáng)1，2王秋華1，2唐寧1，2★

目的本文分析親子鑒定常用STR基因座的三帶型等位基因特點(diǎn)。方法用Chelex法提取3 600例親子鑒定檢案（含8 734個(gè)個(gè)體）血液中的基因組DNA，利用美國ABI公司Amp FISTRR?IdentifilerTMplus試劑盒進(jìn)行復(fù)合熒光PCR擴(kuò)增確定STR基因座的遺傳圖譜（ABI 3500Dx遺傳分析儀），若出現(xiàn)異常峰型則采用PowerPlex?21系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)查驗(yàn)證和采用Yunis技術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞染色體核型分析。結(jié)果2個(gè)檢案分別在D18S51和FGA基因座上出現(xiàn)三帶型等位基因現(xiàn)象（均屬于Ⅰ型），總檢出率為0.229‰（2／8 734），攜帶三帶型等位基因的個(gè)體經(jīng)染色體核型分析均未發(fā)現(xiàn)三體綜合征。結(jié)論三帶型等位基因結(jié)果較少見，判讀須慎重，應(yīng)采用不同試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證以獲得準(zhǔn)確分型。

短串聯(lián)重復(fù)序列；三帶型等位基因；遺傳多態(tài)性

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是一類存在于真核生物基因組中以2～6個(gè)堿基對為核心單位串聯(lián)重復(fù)排列而成的DNA序列。由于STR基因座的高度遺傳多態(tài)性和其在基因傳遞過程中遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律等特點(diǎn)，PCRSTR復(fù)合擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)成為國際法醫(yī)學(xué)界不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)手段，目前被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、親權(quán)關(guān)系鑒定、罪犯識別、疾病分析等方面。正常情況下，任何一個(gè)STR基因座均表現(xiàn)為兩個(gè)等位基因（一個(gè)為父源性，另一個(gè)為母源性），經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳分析后，純合子個(gè)體的圖譜只表現(xiàn)為單一條帶或單個(gè)基因峰，雜合子個(gè)體則表現(xiàn)為兩條帶或兩個(gè)基因峰，不會(huì)出現(xiàn)三帶型或三個(gè)基因峰的現(xiàn)象。Crouse等［1］首次于1999年報(bào)道了三等位基因（tri-allelic pattern）或三帶型等位基因（three-banded allele pattern）現(xiàn)象。根據(jù)各個(gè)等位基因的相對熒光強(qiáng)度可把三帶型等位基因分為兩種類型：一種是熒光強(qiáng)度低的兩個(gè)“小峰”的峰高、峰面積之和等于熒光強(qiáng)度高的主峰的峰高、峰面積（Ⅰ型）；另一種是3個(gè)峰的峰高、峰面積接近相等（Ⅱ型）［2］。隨著PCR-STR復(fù)合擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的發(fā)展，世界各個(gè)法醫(yī)鑒定實(shí)驗(yàn)室或鑒定機(jī)構(gòu)接待的案例越來越多，三帶型等位基因陸續(xù)被報(bào)道。截至2014年12月10日，三帶型等位基因在13個(gè)核心STR基因座（TPOX、CSF1PO、FGA、TH01、vWA、D3S1358、D5S818、D8S1179、D7S820、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11）中已報(bào)道了247例，其中以D18S51和FGA基因座的頻率最高，分別為38種和37種，vWA和D21S11基因座則均有24種［3］。本文通過大樣本分析，對三帶型等位基因的特點(diǎn)和產(chǎn)生原因進(jìn)行了探討，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采集2012年8月到2014年8月柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室親子鑒定檢案3 600例（包括8 734個(gè)中國人群個(gè)體），檢材為人體血樣、帶毛囊毛發(fā)、羊水、組織等。

1.2 方法

1.2.1 Chelex-100法提取血斑DNA

按照文獻(xiàn)［4］報(bào)道采用Chelex-100法提取血斑DNA。剪取受檢樣本約0.5 cm2的血斑，加到0.5 m L的離心管中，加入500μL純水，劇烈振蕩，室溫下放置15m in。13 000 rpm離心3m in，去上清，收集沉淀。在沉淀中加入200μL 5％Chelex-100溶液，在振蕩器上反復(fù)振蕩，放入56℃保溫30 m in以上。取出后振蕩，100℃保溫8m in，振蕩后13 000 rpm離心3 min，上清用于PCR擴(kuò)增，或放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 復(fù)合熒光擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測

運(yùn)用美國ABI公司AmpFISTRR?IdentifilerTMplus試劑盒（包括16個(gè)STR位點(diǎn)：CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、TH01、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、D5S818、FGA和Amelogenin）進(jìn)行復(fù)合熒光PCR擴(kuò)增，若發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)異常峰型則采用PowerPlex?21系統(tǒng)（包括20個(gè)STR位點(diǎn)和1個(gè)性別位點(diǎn)：D1S1656、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、Amelogenin、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA）進(jìn)行復(fù)查驗(yàn)證，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。在美國ABI公司3500Dx遺傳分析儀上進(jìn)行熒光檢測分析，最后采用GeneMapper ID-X-V1.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 染色體核型分析

外周血細(xì)胞染色體核型分析采用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，常規(guī)步驟制備染色體，G顯帶，鏡下計(jì)數(shù)和分析核型。嚴(yán)格按照SOP文件進(jìn)行操作［5］。

2 結(jié)果

2.1 D18S51和FGA基因座毛細(xì)管電泳結(jié)果

檢測3 600個(gè)檢案的血濾紙樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2例親子鑒定的個(gè)案中出現(xiàn)了三帶型等位基因。2例三帶型等位基因結(jié)果見表1。利用Amp FISTRR? IdentifilerTMplus試劑盒對2個(gè)檢案的父親、母親和孩子的血樣DNA進(jìn)行16個(gè)STR位點(diǎn)檢測，其中D18S51和FGA基因座的毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果見圖1。個(gè)案1母親和個(gè)案2孩子的DNA樣品用PowerPlex?21系統(tǒng)重復(fù)驗(yàn)證，進(jìn)行21個(gè)STR位點(diǎn)檢測，其中D18S51基因座的毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖2。與圖1比較可見，個(gè)案1母親的D18S51基因座結(jié)果一致，都檢出17／18／19三個(gè)等位基因，

其信號強(qiáng)度、峰高和峰面積之比約等于2∶1∶1，其中，等位基因19遺傳給了孩子；個(gè)案2孩子的FGA基因座結(jié)果也一致，均檢出22／23／26三個(gè)等位基因，其信號強(qiáng)度、峰高和峰面積之比約等于1∶1∶2，其中23等位基因來自父親，26等位基因來自母親，22等位基因在雙親均未發(fā)現(xiàn)。

2.2 染色體核型分析結(jié)果

對2個(gè)攜帶三帶型等位基因的個(gè)體進(jìn)行了外周血淋巴細(xì)胞染色體核型分析，檢案1母親的核型為46，XX，檢案2孩子的核型為46，XY，均未見染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)明顯異常。結(jié)果表明這2個(gè)個(gè)體未見染色體畸變現(xiàn)象（圖3）。

表1 親子鑒定中三帶型等位基因的遺傳分析Table 1 Genetic analysis of three-banded allele patterns in paternity testing

圖1 Ⅰ型三帶型等位基因攜帶者的親子鑒定圖譜Figure 1 STR profiles of paternity testing with the three-banded allele pattern of TypeⅠ

3 討論

STR是國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)親子鑒定和個(gè)體識別的主要方法，其適用于各種來源的生物性檢材，具有靈敏度高、個(gè)體識別機(jī)率和非父排除率高、PCR檢測所需檢材量少等優(yōu)點(diǎn)。STR主要是在DNA復(fù)制

過程中滑動(dòng)，或復(fù)制和修復(fù)時(shí)滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，引起一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的缺失或插入而形成。單個(gè)STR基因座的PCR擴(kuò)增，其圖譜一般是雜合子個(gè)體有2個(gè)峰或2條帶，而純合子個(gè)體則只有1個(gè)峰或1條帶，正常情況下不會(huì)出現(xiàn)3個(gè)峰或3條帶。但是，在STR的應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)了一些個(gè)體的STR基因座出現(xiàn)3個(gè)峰或3條帶（即三帶型等位基因）。據(jù)STRbase的相關(guān)統(tǒng)計(jì)，目前已報(bào)道三帶型等位基因有363種，其中13個(gè)核心STR基因座共247種，其它常見STR基因座（包括D2S1338、D19S433、Penta D、Penta E、FES／FPS、 SE33、D10S1248和D12S391）共52種，Y染色體STR基因座共64種［3］。

圖2 D18S51和FGA基因座三等位基因圖譜（PowerPlex?21 system）Figure 2 Three-banded allele patterns observed at locus D18S51and FGA（PowerPlex?21 system）

圖3 三帶型等位基因攜帶者的淋巴細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果Figure 3 The results of karyotype analysis of the lymphocytes from the three-banded allele pattern carriers

國內(nèi)研究顯示三帶型等位基因在中國人群的檢出率很低（檢出總頻率為0.721‰），不同基因座的三等型等位基因檢出率存在差異，以D21S11、D18S51和FGA基因座的檢出率較高，檢出率分別為0.172‰、0.137‰和0.103‰［6］。本研究在D18S51和FGA基因組上檢出三帶型等位基因，檢出率為0.114‰（1／8734），這與其他大樣本的三帶型等位基因研究結(jié)果一致［6－7］。研究者發(fā)現(xiàn)不同STR基因座三帶型等位基因的類型分布不同，他們的分

析結(jié)果表明D8S1179基因座三帶型等位基因以Ⅱ型為主（占35％），Ⅰ型占7％；D18S51基因座三帶型等位基因則以Ⅰ型為主（為33％），Ⅱ型為12％；同時(shí)提出體細(xì)胞突變可能是Ⅰ型三帶型等位基因的形成的主要原因，而染色體重組或生殖細(xì)胞中染色體片段的局部重復(fù)可導(dǎo)致Ⅱ型三帶型等位基因的形成［2］。本研究在3 600例親子鑒定（包括8 734個(gè)個(gè)體）案件中發(fā)現(xiàn)了2例Ⅰ型三帶型等位基因，峰高較低的兩個(gè)等位基因均只相差一個(gè)核心重復(fù)序列，推測可能是原本為雜合子的兩個(gè)等位基因在個(gè)體發(fā)育過程中，其中一個(gè)等位基因發(fā)生了一步滑動(dòng)錯(cuò)配，從而產(chǎn)生新的等位基因［2，8］。我們重復(fù)提取DNA，按不同試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Amp FISTRR?IdentifilerTMplus試劑盒和PowerPlex?21系統(tǒng)）、毛細(xì)管電泳、分析，其檢測結(jié)果相吻合，提示檢出的三帶型等位基因不是PCR擴(kuò)增引起的非特異產(chǎn)物，也不是實(shí)驗(yàn)室的污染或電泳時(shí)泳道滲漏造成的假象。

目前關(guān)于三帶型等位基因產(chǎn)生的機(jī)制尚不太清楚，研究者們［2，9-10］認(rèn)為可能的機(jī)制主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）在減數(shù)分裂時(shí)父系或母系同源染色體不分離而整體遺傳給子代，即出現(xiàn)三多倍體現(xiàn)象。三帶型等位基因的出現(xiàn)在染色體畸形導(dǎo)致的三體綜合征時(shí)比較常見，但是在正常人群中出現(xiàn)頻率較低，本文案例1的母親D18S51基因座出現(xiàn)了17／18／19三帶型等位基因，其余STR位點(diǎn)正常，懷疑該母親患有18三體綜合征，雖然該病患者壽命一般很短，但是也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)成年人18三體病例。我們對該母親外周血進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析后發(fā)現(xiàn)，18號染色體并未增多，可見該母親在18號染色體上出現(xiàn)的三帶型等位基因并非由于父系或母系同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)不分離而整體遺傳給子代而造成的。（2）同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)出現(xiàn)不等價(jià)交換導(dǎo)致等位基因重復(fù)。個(gè)體發(fā)生易位（translocation），染色體或某些位點(diǎn)有重復(fù)均可影響STR的分型結(jié)果。如果重復(fù)伴隨有核心重復(fù)序列的缺失或插入，可形成三條帶的帶型。（3）在受精卵發(fā)育過程中染色體不分離產(chǎn)生不同基因型細(xì)胞組成的嵌合體（由兩種或多種不同染色體核型的細(xì)胞組成），在PCR-STR分型時(shí)也可形成三帶型等位基因。（4）STR的不穩(wěn)定性與許多腫瘤有關(guān)，包括肺癌、消化道腫瘤、前列腺癌、婦科腫瘤、腎腫瘤和白血病等。發(fā)生腫瘤病變的組織或細(xì)胞，可以在一些STR位點(diǎn)檢出三條或三條以上的帶。（5）骨髓移植或臍血移植受者體內(nèi)有供者的細(xì)胞生長，這些特殊個(gè)體在PCR-STR分型中，可以檢出有多條帶，或不同組織檢出不同的基因型。

近幾年來關(guān)于三帶型等位基因是如何遺傳給后代的課題已成為新的研究熱點(diǎn)。2008年Vidal等［11］通過三代5個(gè)家庭成員的家系分析發(fā)現(xiàn)孫女D3S1358基因座三帶型等位基因來源于其祖母。土耳其一對近親結(jié)婚（哥哥和妹妹）的夫婦，他們均為三帶型等位基因攜帶者（攜帶16／17／18等位基因），生下了一個(gè)四等位基因（17和18等位基因均為雙拷貝）的孩子［12］。巴西里約熱內(nèi)盧天主教大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)采集了一個(gè)四代45個(gè)家庭成員的大家系，發(fā)現(xiàn)6名女性成員攜帶TPOX基因座的三帶型等位基因（屬于Ⅱ型），核型結(jié)果顯示2號染色體短臂未見部分三體。攜帶者的基因型均為8／10／11，推測攜帶者所有細(xì)胞的TPOX基因座序列為三拷貝，10等位基因?yàn)門POX基因座的額外形成的第三個(gè)等位基因，因其距離TPOX基因座較遠(yuǎn)，推測10等位基因可能與Xq存在連鎖關(guān)系［13］。2014年國內(nèi)學(xué)者提出Ⅰ型三帶型攜帶者隨機(jī)傳遞一個(gè)等位基因給子代，Ⅱ型攜帶者可遺傳兩個(gè)等位基因給子代［6］。在本文的2例檢案中，檢案1雖然沒有遺傳給后代，但特別值得一提。母親的17等位基因的峰面積約等于18、19等位基因峰面積的總和，提示等位基因17可能有兩個(gè)拷貝，它的基因型可能是17／18和17／19，在減數(shù)分裂時(shí)，染色體分離并將其中一條傳給子代，但子代中并沒有出現(xiàn)17／19等位基因，只有19等位基因傳給了子代。檢案2的三帶型等位基因只發(fā)現(xiàn)于孩子中，父母均正常，無法了解是否會(huì)遺傳。本研究檢出三帶型等位基因例數(shù)較少，并且僅觀察了兩代的遺傳情況，進(jìn)行多代研究和積累更多的案例是后續(xù)研究的方向。目前對于親子鑒定案件涉及的三帶型STR基因座尚無統(tǒng)一的親權(quán)指數(shù)（paternity index，PI）計(jì)算方法［14］，一般將親代傳給子代的兩個(gè)等位基因視為整體進(jìn)行計(jì)算［15］。

綜上所述，在親子鑒定檢案中三帶型等位基因現(xiàn)象極為少見，容易被忽視。因此，在PCR-STR

分型時(shí)出現(xiàn)此現(xiàn)象需引起重視。若發(fā)現(xiàn)可疑三帶型等位基因，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)（包括標(biāo)本提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析等全過程），排除泳道滲漏或者模板污染等問題；同時(shí)采用其他試劑盒或方法相互驗(yàn)證結(jié)果以免發(fā)生誤判，保證鑒定結(jié)論的準(zhǔn)確性、可靠性和科學(xué)性。

[1]Crouse CA,Rogers S,Amiott E,et al.Analysis and interpretation of short tandem repeat microvariants and three-banded allele patterns using multiple allele detection systems[J].JForensic Sci,1999,44(1):87－94. [2]Clayton TM,Guest JL,Urquhart AJ,et al.A genetic basis for anomalous band patterns encountered during DNA STR profiling[J].JForensic Sci,2004,49(6): 1207－1214.

[3]John M.Short tandem repeat DNA internet database [DB/OL].http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/tri_tab. htm,2014-12-09/2014-12-25.

[4]Walsh PS,Metzger DA,Higuchi R.Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].Biotechniques,1991, 10(4):506-513.

[5]Yunis JJ.New chromosome techniques in the study of human neoplasia[J].Hum Pathol,1981,12(6):540-549.

[6]陳玲,劉超,邱平明,等.常染色體STR基因座三帶型的觀察與分[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(4):316-318.

[7]Leclercq S,Rivals E,Jarne P.DNA slippage occurs at m icrosatellite loci w ithout minimal threshold length in humans:a comparative genomic approach[J].Genome Biol Evol,2010,2:325-335.

[8]Jenkins PA,Mueller JW,Song YS.General triallelic frequency spectrum under demographic models w ith variable population size[J].Genetics,2014,196(1): 295-311.

[9]Hodgkinson A,Eyre-Walker A.Human triallelic sites: evidence for a new mutational mechanism?[J]. Genetics,2010,184(1):233-241.

[10]韓莉莉,潘棱,沈曉麗,等.STR基因座中檢出三帶型等位基因三例及遺傳分析[J].海南醫(yī)學(xué),2011,22(15): 1-3.

[11]Vidal C,Cassar M.A case of tri-allelic pattern at locus D3S1358 on chromosome 3p21 inherited from paternal grandmother[J].Forensic Sci Int Genet,2008,2(4):372-375.

[12]Canturk KM,Em re R,Muslumanoglu O,et al.Brothersister incest paternity case w ith the same tri-allelic pattern of parents at D3S1358 locus:a tetra-allelic baby? [J].Int JLegal Med，2014，[Epub ahead of print].

[13]Pican?o JB,Raimann PE,Paskulin GA,et al.Triallelic pattern at the TPOX locus:a fam ilial study[J]. Gene,2014,535(2):353-358.

[14]林漢光,許傳超,唐劍頻,等.常染色體STR三體基因座父權(quán)指數(shù)計(jì)算方法探討[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2013, 28(5):400-403.

[15]Charles HB.Forensic mathematics[EB/OL].http:// charlesbrenner.com/,2014-12-19/2014-12-25.

Genetic polymorphism analysis of two short tandem repeat three-banded allele patterns

XU Zehui1,2,YAN Tizhen1,2,LUO Shiqiang1,2,WANG Qiuhua1,2,TANG Ning1,2★
(1.Department of Clinical Laboratory,Liuzhou Maternal and Child Care Hospital,Liuzhou,Guangxi,China, 545001；2.Liuzhou Key Laboratory of Birth Disease Prevention and Control,Liuzhou,Guangxi,China, 545001)

Objective To analyze t he characteristics of three-banded alleles patterns.Methods Genom ic DNA was extracted from blood samples of 3 600 paternity cases(including 8 734 individuals)by using Chelex method.Genetic profiles of STR loci were determ ined by multiplex fluorescence PCR amplification w ith the Amp FISTRR?IdentifilerTMplus kit(ABI,America).Re-analysis was performed by using the PowerPlex?21 system,and the karyotype of lymphocytes was analysed by Yunis'technique.

Short tandem repeat；Three-banded allele pattern；Genetic polymorphism

柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2014G020404）

1.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西，柳州545001 2.柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西，柳州545001

★通訊作者：唐寧，E-mail：tn825＠126.com

注：許澤輝，嚴(yán)提珍為并列第一作者

Results 2 Type1 three-banded allele patterns at D18S51 and FGA loci were observed.The frequency for tri-allelic patterns in autosomal STRs was 0.229‰.Karyotype analysis showed no occurrence of trisomy w ith the three-banded patterns carriers.Conclusion Three-banded allele pattern events are extremely rare in paternity cases which need to be carefully assessed,and different amplification kit should be used to validate the results to obtain accurate genotyping.