糖皮質(zhì)激素個(gè)體化用藥系統(tǒng)平臺的建立與評價(jià)

王昌富彭長華李琳蕓梅冰

·論著·

糖皮質(zhì)激素個(gè)體化用藥系統(tǒng)平臺的建立與評價(jià)

王昌富1.2★彭長華1.2李琳蕓1.2梅冰1.2

目的建立可靠的糖皮質(zhì)激素（GC）實(shí)驗(yàn)診斷系統(tǒng)平臺。方法采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人工合成GC藥物（潑尼松、甲基潑尼松和地塞米松）血藥濃度，流式細(xì)胞分析法檢測糖皮質(zhì)激素受體（GR）-α蛋白，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光基因擴(kuò)增定量分析法檢測GR-αmRNA，并進(jìn)行了方法學(xué)分析。結(jié)果質(zhì)譜法檢測PNS、DPNS、DX血藥濃度分別在1～15 ng／m L、1～100 ng／m L、20～400 ng／m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)本置26℃6 h、置－20℃30 d、加甘油三酯13.21 mmol／L、加總膽紅素162.8μmol／L，比較各組血藥濃度未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PNS、DPNS、DX血藥濃度日內(nèi)CV分別小于10.81％、7.98％、5.47％，日間CV分別小于10.72％、6.29％、12.36％?；厥章试囼?yàn)顯示PNS、DPNS、DX在20 ng／m L、20 ng／m L、400 ng／m L濃度的平均回收率分別是99.91％、102.49％、109.89％。流式細(xì)胞術(shù)分析GR-α蛋白，標(biāo)本立即處理檢測與放置6 h、24 h后處理檢測結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，標(biāo)本處理后5 h檢測結(jié)果無顯著性變化，3種抗體反應(yīng)條件（室溫孵育30 m in、37℃孵育30 m in、4℃孵育6 h）檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，百分率及熒光強(qiáng)度CV值分別為3.4％與9.8％。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光基因擴(kuò)增定量分析法檢測GR-αmRNA檢測靈敏度達(dá)到101copies／μL，批內(nèi)和批間Ct值變異系數(shù)均小于2.0％。結(jié)論初步證實(shí)本體系設(shè)計(jì)科學(xué)、方法先進(jìn)、系統(tǒng)可靠。

糖皮質(zhì)激素；個(gè)體化用藥；質(zhì)譜

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）由腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞合成與分泌，廣泛介導(dǎo)人體生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等多種生理和病理過程。人工合成GC是常用的治療藥物之一，通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)發(fā)揮藥效，具有抗炎、抗毒、抗腫瘤和免疫抑制作用。作為配體發(fā)揮作用的主要受體，GRα蛋白幾乎表達(dá)于所有的被檢測的組織與細(xì)胞中，并入核與GRE序列結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)［1，2］。因此，檢測血藥濃度、受體分子水平和基因表達(dá)狀況，建立可靠的糖皮質(zhì)激素實(shí)驗(yàn)診斷系統(tǒng)平臺對于協(xié)助制定針對患者的個(gè)體化治療方案、療效監(jiān)測，從而確保GC個(gè)體化用藥的臨床效果很有意義。

1 材料與方法

1.1 本實(shí)驗(yàn)診斷平臺所涉及的項(xiàng)目、方法、器材與儀器［3－5］。

1.1.1 GC血藥濃度的檢測

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測儀器為UPLC-ACQUITY?TQD（WATERS，USA），標(biāo)準(zhǔn)品為PNS-d4、DPNS-d4、DX-d5（Torarto Research Chemicacs），提取液使用二氯甲烷，流動(dòng)相A為0.02％甲酸乙腈，流動(dòng)相B為0.02％甲酸水，色譜純。

1.1.2 GR-α蛋白和GR-αmRNA表達(dá)水平的檢測

采用流式細(xì)胞分析法檢測GR-α蛋白，儀器為Epics XL Flow Cytometer（Beckman Coulter，USA），標(biāo)準(zhǔn)品采用兔抗IgG（Coulter Immunotech），主要試劑為兔抗人的GR-α多克隆抗體（Santa Cruz）、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（Sigma）、細(xì)胞破膜劑（Coulter Immunotech）。

1.1.3 GR-αmRNA測定采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光基因擴(kuò)增定量分析法

儀器為7300 Real Time PCR System（Appied Bio Systems，USA）。反應(yīng)體系：Prem ix ExTM Taq（2×）25μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10 μM）1μL，熒光探針（10μM）2μL，ROX Reference Dye（50×）1μL，已制備的cDNA模板3μL，加水使總反應(yīng)體積為50μL。反應(yīng)條件：采用兩步法，首先95℃預(yù)變性30 s，然后95℃變性5 s，60℃退火和延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)標(biāo)。利用已制備的已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒（重組載體：大腸桿菌DH52α，上海英俊公司）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算GR-αmRNA的相對含量。

2 性能評價(jià)方法

2.1 血藥濃度檢測

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的貯存液（1mg／m L）進(jìn)行梯度稀釋（表1），以標(biāo)準(zhǔn)品與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f對濃度c作線性回歸分析。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用液濃度（ng／m L）Table 1 The standard curve w ith concentration（ng／m L）

2.1.2 標(biāo)本穩(wěn)定性與干擾試驗(yàn)

將基質(zhì)血清添加10管，按表2處理。以A管為基準(zhǔn)，其余各管測定值與基準(zhǔn)值比較。

表2 標(biāo)本穩(wěn)定性與干擾試驗(yàn)Table 2 Sample stability and interference test

2.1.3 精密度與回收率試驗(yàn)

取1.5m L離心管15支，分別加入空白血清270μL。每5管分別加入S2、S3、S4的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液30μL。每天檢測5管計(jì)算日內(nèi)精密度，3日共檢測15管計(jì)算日間精密度，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

2.2 GR蛋白表達(dá)

2.2.1 標(biāo)本穩(wěn)定性

標(biāo)本獲取后立即處理檢測或者分別于4℃保存放置6 h、24 h后處理檢測；標(biāo)本處理后立即檢測或者處理后于4℃避光保存放置3 h、4 h、5 h、20 h、24 h檢測。

2.2.2 檢測抗體孵育條件

室溫孵育30m in、37℃孵育30m in、4℃孵育6 h。

2.2.3 檢測精密度

以標(biāo)準(zhǔn)檢測程序?qū)?biāo)本重復(fù)檢測5次后計(jì)算陽性細(xì)胞百分率及熒光強(qiáng)度的CV值。

2.3 GRmRNA水平

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對質(zhì)粒原液進(jìn)行稀釋，制備出不同濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：101～105copies／μL，進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR。

2.3.2 精密度

將102copies／μL和104copies／μL的標(biāo)準(zhǔn)品平行操作5次或在5天內(nèi)分別測定，獲取批內(nèi)與批間變異系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 血藥濃度檢測

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

PNS、DPNS、DX標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為：c＝－0.075＋24.747f（r＝0.9969）、c＝0.089＋96.240f（r＝0.9998）、c＝－6.440＋14.071f（r＝0.9995）。結(jié)果表明，PNS、DPNS、DX血藥濃度分別在1～15 ng／m L、1～100ng／m L、20～400ng／m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2 標(biāo)本穩(wěn)定性與干擾試驗(yàn)

各組間PNS、DPNS、DX血藥濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明藥品在血清中穩(wěn)定（S2：F／P＝0.792／0.563、0.407／0.841、1.373／0.260；S3：F／P＝0.997／0.434、1.045／0.399、1.429／0.236）。UPLC－MS圖譜見圖1。

3.1.3 精密度與回收率試驗(yàn)

PNS、DPNS、DX在3種血藥濃度的日內(nèi)（n＝5）CV分別小于10.81％、7.98％、5.47％。日間（n＝15）CV分別小于10.72％、6.29％、12.36％。PNS、DPNS、DX在S2濃度的平均回收率分別是99.91％、102.49％、109.89％。

3.2 GR蛋白表達(dá)細(xì)胞陽性率和熒光強(qiáng)度

標(biāo)本立即處理檢測與放置6 h、24 h后處理檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。標(biāo)本處理后5 h檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3種反應(yīng)條件無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（使用SPSS11.5進(jìn)行方差分析，均P＞0.05）。CV值分別為3.4％與9.8％。

3.3 GRmRNA水平

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

直線回歸方程y＝－3.388x＋37.198，相關(guān)系數(shù)r＝0.9885，顯示模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系。檢測靈敏度達(dá)到10 copies／μL。

3.3.2 精密度

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示批內(nèi)和批間Ct值變異系數(shù)均小于2.0％，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

4 討論

整體水平上，GR基因表達(dá)水平的高低和GR分子密度的多少與糖皮質(zhì)激素的敏感性不同有關(guān)。GC用于臨床后多數(shù)患者可明顯改善癥狀，取得良好治療效果，而部分患者對GC治療存在抵抗；GC在臨床治療中越廣泛的應(yīng)用，而個(gè)體反應(yīng)性差異和耐藥性等問題則日益明顯凸顯［6－8］。因此建立檢測GC血藥濃度、GR蛋白分子和GR基因表達(dá)水平的綜合實(shí)驗(yàn)診斷平臺對于選擇和確定GC治療方案非常必要。

圖1 糖皮質(zhì)激素檢測UPLC-MS圖譜Figure 1 UPLC-MSmaps of glucocorticoid detection

表3 GR-αmRNA的批內(nèi)和批間精密度檢測結(jié)果Table 3 The testing results of intra batch and inter batch precision GR-αmRNA

本文對于檢測方法的穩(wěn)定性、特異性、重復(fù)性和線性等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)，初步證實(shí)本體系設(shè)計(jì)科學(xué)、方法先進(jìn)、系統(tǒng)可靠。從GC的藥理本質(zhì)方面進(jìn)行研究，不僅可以檢測GC血藥濃度，還能反映GR基因表達(dá)水平和GR分子密度，應(yīng)用臨床醫(yī)療后將在個(gè)體化用藥方案中發(fā)揮極大的作用。

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Establishment and evaluation of glucocorticoid individualized medication system platform

WANG Changfu1.2★,PENG Changhua1.2,LI Linyun1.2,MEIBing1.2
(1.Department of L aboratory M edicine,Jingzhou Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou,Hubei,China,434020；2.Department of Immunology Research,School of Medicine,Yangtze University,Jingzhou,Hubei,China,434020)

Objective To establish reliable glucocorticoid hormone experimental diagnosis system platform.Methods Blood drug concentrations of synthetic glucocorticoid(GC),including prednisone (PNS),methyl prednisone(DPNS)and dexamethasone(DX),weremeasured through ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Expression levels of Glucocorticoid receptor-alpha(GR-α)protein were detected through flow cytometry.mRNA levels of GR-αwere measured by using reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR.Methodological index were also analyzed,including sensitivity, precision,interference and recovery ratio,etc.Results Detections of PNS,DPNS and DX blood concentration using mass spectrometry showed good linear relationship in 1－15 ng/m L,1－100 ng/m L and 20～400 ng/m L,respectively.Preservation of specimens in 26℃for 6h,－20℃30 days,addition of 13.21 mmol/L triglyceride or 162.8μmol/L total bilirubin had no significant effect on the results.The intra-day CVs of PNS,DPNS and DX blood concentration were less than 10.81％,7.98％and 5.47％,and inter-day CV less than 10.72％,6.29％and 12.36％,respectively.The average recovery ratio of PNS,DPNS and DX

Glucocorticoid；Individualized medication；Mass spectrum

湖北省科技廳攻關(guān)計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目（2007AA301C54）

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，湖北，荊州434020 2.長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究室，湖北，荊州434020

★通訊作者：王昌富，E-mail：jzyyjyk＠sina.com

(concentration at 20 ng/m L,20 ng/m L or 400 ng/m L,respectively)were 99.91％,102.49％and 109.89％.No significant difference existed between the levels of GR-αprotein detected immediately and after preserving samples for 6h or 24 h using flow cytometry.The results detected at 5h time point after sample processing also showed no significant discrepancy.The results of 3 antibody reaction conditions(incubation for 30 m in at room temperature,30 m in at 37℃or 6 h at 4℃)were no statistically different.The precision test showed CVs of percentage and fluorescence intensity were 3.4％and 9.8％.The sensitivity of GR-α mRNA detection w ith reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR was up to 101copies/L.The precision test showed that the intra-and inter-assay coefficients of variation were both less than 2％.Conclusion The glucocorticoid hormone experimental diagnosis system platform is prelim inarily confirmed to be scientific,advanced and reliable.