茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)的SPME萃取條件優(yōu)化研究

盧 健 傅得均 吳東芬 劉 瑜 駱耀平*

(浙江大學(xué)茶葉研究所，杭州310058;2.金華萌芽茶業(yè)有限公司，金華321042)

香氣是茉莉花茶品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要因子，在花茶感官審評(píng)權(quán)重占40%［1］。因此，分析研究茉莉花茶中的揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)于探究花茶的香氣品質(zhì)形成以及改進(jìn)加工工藝具有重要的參考價(jià)值。前人對(duì)茉莉花茶揮發(fā)性成分研究時(shí)，多采用SDE法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的提?。?-8］。但該法提取溫度較高(影響受溫度變化揮發(fā)性物質(zhì)量的變化)，提取時(shí)間較長(zhǎng)，過程繁瑣。20世紀(jì)90年代初興起的SPME法，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，具有樣品用量少、選擇性高、使用方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，自問世來便廣泛應(yīng)用于氣態(tài)、水體、固態(tài)樣品中的揮發(fā)物和半揮發(fā)性有機(jī)物以及無機(jī)物的分析［9］，并已用于茶葉揮發(fā)性成分的萃取。該法對(duì)茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取已有報(bào)道［10-13］，但SPME方法下對(duì)花茶揮發(fā)性物質(zhì)的萃取條件不盡相同，結(jié)果差異較大。為使試驗(yàn)結(jié)果得到比較，借鑒前人的研究結(jié)果，探索利用SPME法萃取茉莉花茶揮發(fā)性組分的測(cè)定條件，為之后的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用傳統(tǒng)二窨一提加工工藝窨制而成的茉莉花茶(為防止白蘭花中揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，未用其打底)。用于加工茉莉花茶的原料為福鼎大白茶品種加工而成的烘青毛茶，精制后作為加工花茶的茶坯。付窨用花為雙瓣茉莉，采自金華市婺城區(qū)金店村。加工而成的茉莉花茶樣以鋁箔袋密封，保存于-20℃冰柜中待用。

1.2 試驗(yàn)試劑與主要儀器設(shè)備

試驗(yàn)用化學(xué)試劑為分析純。正構(gòu)烷烴混標(biāo)(nalkane，C8-C20，Sigma-Aldrich，USA)。

SPME手持器(SAAB-57330U)和65 μm聚二甲基/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭(美國(guó)Supelco公司);6890氣相色譜-5973質(zhì)譜儀(Agilent公司);50 mL頂空萃取瓶;BS124S電子天平(Sartorius公司);HH-2型可控?cái)?shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 SPME萃取條件的優(yōu)化 本試驗(yàn)采用能夠更好保持完整香氣信息的干茶法［14，15］，即直接將干茶置于萃取瓶中，封口膜密封后，插入萃取頭進(jìn)行萃取。根據(jù)"相似相溶"原理，分析前人試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)選用對(duì)極性揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果較好的65 μm PDMS/DVB萃取頭。利用SPME法萃取揮發(fā)性物質(zhì)，其效果受萃取纖維固定相、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品體積等因素影響［16］。本試驗(yàn)研究了試驗(yàn)用茶量、萃取溫度和萃取時(shí)間三個(gè)因素對(duì)茉莉花茶萃取效果的影響。在試驗(yàn)因素的水平設(shè)置時(shí)，本試驗(yàn)除了對(duì)待優(yōu)化因素設(shè)置不同水平外，其他因素參考了本課題組之前對(duì)綠茶揮發(fā)性物質(zhì)確定的優(yōu)化條件，用茶量依試驗(yàn)結(jié)果定。

(1)試驗(yàn)用茶量 茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)萃取研究中，不同茶類的用茶量從 2g 到 10g 不等［14，15］，依前人試驗(yàn)的結(jié)果，本試驗(yàn)選設(shè) 2.5 g、5 g、7.5 g 和 10 g四個(gè)處理，另選擇本實(shí)驗(yàn)室已獲萃取溫度60℃、萃取時(shí)間40 min［17］的試驗(yàn)條件，置茶樣于50 mL萃取瓶中，在60℃水浴條件下萃取40 min。

(2)萃取溫度 已有研究綠茶、烏龍茶、黃茶、普洱茶和茉莉花茶中揮發(fā)性物質(zhì)，所選萃取溫度分別有 60℃、60℃、80℃、40℃和 50℃［15，17-20］。據(jù)此，本試驗(yàn)設(shè) 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五個(gè)處理。選擇萃取時(shí)間40 min，試驗(yàn)用茶量依上一試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果確定。

(3)萃取時(shí)間各地研究中對(duì)茶葉揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定的萃取時(shí)間有較大差異，資料表明，所用時(shí)間從20 ～80 min 不等［14，15，17-20］，為此，本試驗(yàn)設(shè) 20 min、40 min、60 min、80 min四個(gè)萃取時(shí)間，選擇萃取溫度60℃，根據(jù)試驗(yàn)用茶量試驗(yàn)選擇合適的用茶量。

1.3.2 揮發(fā)性化合物的氣相質(zhì)譜分析(GC/MS)SPME萃取完成后，將纖維頭插入GC進(jìn)樣口，熱解吸附3.5 min。每一樣品重復(fù)3次。

GC條件:色譜柱為HP-innowax色譜柱(30 m×0.25 mm ID ×0.25 μm 膜厚);載氣為高純 He，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度為250℃，ECD檢測(cè)器溫度為250℃;初始柱溫為50℃，保持5 min，以3℃/min升溫至220℃，保持5 min，再以10℃/min升溫至240℃，保持5 min，不分流進(jìn)樣。

MS條件:離子化方式為EI，離子源溫度230℃，四級(jí)桿的溫度150℃，電子能量70 eV，檢測(cè)器電壓350 V，色譜-質(zhì)譜接口溫度260℃，質(zhì)量掃描范圍為35 ～450 a.m.u.。

1.3.3 揮發(fā)性化合物的數(shù)據(jù)處理與分析 物質(zhì)的譜庫鑒定、MS峰鑒定及保留指數(shù)(RI)鑒定方法同林杰［15］。

以往對(duì)茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)的研究表明，茉莉花茶中芳樟醇、乙酸芐酯、α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚六種物質(zhì)相對(duì)含量最大，約占全部揮發(fā)性物質(zhì)的 85%［2］(SDE法)或79%［13］(SPME法)。在進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化萃取條件時(shí)，選擇該六種物質(zhì)為主要比較對(duì)象。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件包(Version 16.0 for Windows，SPSS Inc.Chicage，Ⅱ，2007)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，平均值之間比較采用單因素方差分析，不同處理間差異采用Duncan法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為α =0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)用茶量對(duì)萃取效果的影響

已有研究表明，茉莉花茶中芳樟醇、乙酸芐酯、α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚六種揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量約占全部揮發(fā)性物質(zhì)的 85%［2］(SDE 法)或 79%［13］(SPME 法)，選擇這六種物質(zhì)分析比較，利于主要問題的剖析。不同試驗(yàn)用茶量與茉莉花茶中六種大量揮發(fā)性組分峰面積的關(guān)系如圖1所示。結(jié)果表明，六種物質(zhì)中，有些隨用茶量增加，峰面積對(duì)數(shù)值變化小，有些超過一定用茶量后，峰面積對(duì)數(shù)值下降。芳樟醇和乙酸芐酯兩種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值在各不同用茶量處理下變化小，處理間差異不顯著。其它四種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值，在用茶量小于5 g范圍內(nèi)差異不顯著;鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚的峰面積對(duì)數(shù)值，用茶量7.5 g時(shí)，與之前用茶量條件下差異不顯著，用茶量10 g時(shí)顯著低于5 g處理;α-法尼烯和苯甲酸順-3-己烯酯，在用茶量超過5 g時(shí)，峰面積對(duì)數(shù)值下降，且與5 g用茶量差異顯著。換言之，六種主要成分中，有兩種成分的峰面積對(duì)數(shù)值在7.5 g與5 g處理間差異顯著。由此認(rèn)為，利用SPME檢測(cè)茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)時(shí)，花茶揮發(fā)性物質(zhì)中占80%以上的六種物質(zhì)的萃取量，在用茶量2.5 g～5 g時(shí)變化較穩(wěn)定。

圖1 不同用茶量對(duì)茉莉花茶中六種香氣成分萃取效果的影響

2.2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

SPME提取、富集樣品的過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，溫度通過影響揮發(fā)性物質(zhì)在各相之間的分配系數(shù)，對(duì)萃取效果產(chǎn)生影響［16］。不同萃取溫度條件下，六種主要揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效果如圖2所示，由圖可以看到，萃取溫度60℃，是這六種揮發(fā)性物質(zhì)峰面積對(duì)數(shù)值變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。α-法尼烯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚三種物質(zhì)低于60℃時(shí)，峰面積對(duì)數(shù)值隨溫度升高而快速增加，各溫度處理間差異顯著，高于60℃時(shí)峰面積對(duì)數(shù)值變化量差異不顯著;苯甲酸順-3-己烯酯在60℃之前溫度條件下萃取，峰面積對(duì)數(shù)值也是增加，且增加速度明顯較前面三種物質(zhì)快，50℃、60℃處理的峰面積對(duì)數(shù)值與前一處理相比分別增加了4.02%和3.75%(前面三種物質(zhì)峰面積對(duì)數(shù)值增加最快的為3.26%);之后的溫度處理下，仍有增加，但增加速率減緩，70℃、80℃處理的峰面積對(duì)數(shù)值與前一處理相比分別增加了1.16%和0.89%;其他兩種物質(zhì)在不同萃取溫度處理下，峰面積對(duì)數(shù)值的變化表現(xiàn)為隨萃取溫度升高，峰面積對(duì)數(shù)值減少。其中，乙酸芐酯在60℃之前，曲線變化有下降趨勢(shì)，顯著性測(cè)定不顯著，萃取溫度高于60℃時(shí)，顯著下降;芳樟醇在60℃之前下降快速，之后，變化不顯著。根據(jù)這六種揮發(fā)性物質(zhì)的綜合變化，萃取溫度60℃時(shí)，這些揮發(fā)性物質(zhì)處于一個(gè)較高或較穩(wěn)定的位置，因此，利用該方法的萃取溫度選擇60℃合適。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

2.3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

不同萃取時(shí)間與茉莉花茶中六種大量揮發(fā)性物質(zhì)峰面積變化關(guān)系如圖3所示，可以看出，隨萃取時(shí)間的增加，六種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值先增加，40 min時(shí)，峰面積對(duì)數(shù)值處于較高位置，增加較多的α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚四種物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值與20 min時(shí)相比，分別增加了 2.41%、3.61%、1.86% 和 1.36%。40～60 min六種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的變化中，80min時(shí)略有下降。在試驗(yàn)處理時(shí)間內(nèi)，乙酸芐酯峰面積對(duì)數(shù)值變化不顯著。芳樟醇峰面積對(duì)數(shù)值隨時(shí)間的延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，20 min處理和80 min處理下差異顯著，其他時(shí)間處理下差異不顯著。其他四種揮發(fā)性物質(zhì)峰面積對(duì)數(shù)值隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)有較一致的變化。萃取時(shí)間為20～40 min時(shí)，四種揮發(fā)性物質(zhì)峰面積對(duì)數(shù)值顯著增加;萃取時(shí)間超過40 min，苯甲酸順-3-己烯酯的峰面積對(duì)數(shù)值仍增加，但趨勢(shì)減緩，萃取60 min時(shí)與40 min萃取結(jié)果差異顯著;其它三種揮發(fā)性物質(zhì)在40～80 min范圍內(nèi)變化差異不顯著。

HS-SPME萃取過程是待測(cè)物在介質(zhì)相、頂空相和萃取纖維相的分配平衡過程，要達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡需要一定的時(shí)間。由試驗(yàn)結(jié)果可以看到，萃取時(shí)間在20～40 min(包括40 min)范圍內(nèi)，α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚四種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值隨時(shí)間的增加顯著增加;萃取時(shí)間40～60 min，六種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對(duì)數(shù)值處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的變化中，80 min時(shí)略有下降。因此，萃取時(shí)間以40～60 min為合適。

3 討論

茉莉花茶中已提取分析得到七十種以上揮發(fā)性物質(zhì)［15］，是一個(gè)多組分、多相的混合系統(tǒng)，這些物質(zhì)的揮發(fā)性強(qiáng)弱、沸點(diǎn)等性質(zhì)不同，被茶坯吸附的能力不同，有些吸附后不易分離，有些則相反，隨時(shí)間、用茶量、溫度等變化，這些性質(zhì)都會(huì)得到反映。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

試驗(yàn)條件下，占揮發(fā)性物質(zhì)約80%的六種物質(zhì)，不同用茶量處理時(shí)，以用茶量2.5～5 g時(shí)物質(zhì)變化較為穩(wěn)定，超過5 g用茶量，差異較大，可見并非是用茶量越多萃取效果越佳。以往一些研究有10 g用茶量處理，此時(shí)，主要的六種物質(zhì)中有四種揮發(fā)性物質(zhì)(α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚)與用茶量小時(shí)(5 g)差異顯著，與相鄰處理也有較大差異。因此，試驗(yàn)用茶量以2.5～5 g為合適。

萃取溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)萃取溫度在60℃以下時(shí)，六種主要物質(zhì)峰面積對(duì)數(shù)值還處于較大的變化之中，60℃ ～80℃時(shí)，變化較小。由此認(rèn)為，60℃ ～80℃溫度范圍內(nèi)萃取是合適的溫度條件，但在合適溫度范圍條件下，較低溫度對(duì)因不同溫度變化而帶來影響的揮發(fā)性物質(zhì)的保持有利［14］，據(jù)此，優(yōu)先選擇萃取溫度條件為60℃。

不同萃取時(shí)間內(nèi)，主要的六種揮發(fā)性物質(zhì)量都有不同的變化，萃取時(shí)間40～60 min范圍內(nèi)，六種揮發(fā)物質(zhì)峰面積隨時(shí)間變化趨緩。因此，萃取時(shí)間以40～60 min為宜。

物質(zhì)的飽和蒸汽壓越大，揮發(fā)性越強(qiáng)。六種主要揮發(fā)性物質(zhì)中，芳樟醇和乙酸芐酯的飽和蒸汽壓高于其它四種物質(zhì)［21］，推知芳樟醇和乙酸芐酯比其它四種物質(zhì)的揮發(fā)性強(qiáng)。此外，芳樟醇和乙酸芐酯的沸點(diǎn)低于其它四種物質(zhì)。因此，不同溫度、時(shí)間優(yōu)化時(shí)可以看到這兩種物質(zhì)的含量均在較短時(shí)間和較低溫度下達(dá)到較高水平。

1 茶葉感官審評(píng)方法:GB/T 23776-2009.中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

2 駱少君，郭雯飛，濮荷娟.我國(guó)茉莉花茶香氣揮發(fā)油與品質(zhì)等級(jí)的相關(guān)性.福建茶葉，1987(2):2-10.

3 駱少君，郭雯飛，濮荷娟.茉莉花茶香氣揮發(fā)油與窨次、配花量的相關(guān)性.福建茶葉，1987(3):18-21.

4 梁靖，須海榮，蔣文莉，王漪.溫度對(duì)茶葉香氣的影響.茶葉，2002，28:194-196.

5 施夢(mèng)南，龔淑英.茶葉香氣研究進(jìn)展.茶葉，2012，38:19-23.

6 陸寧，宛曉春，潘冬.茉莉花茶香氣成分與品質(zhì)之間關(guān)系的初步研究.食品科學(xué)，2004，25(6):93-95，97.

7 蔣顧偉，廖明宏，李擁軍.窨制茉莉花茶與添加香精茉莉花茶香氣成分的差異性分析.茶葉通訊，2005(3):17-20.

8 Liang Y，Wu Y，Lu J，et al.Application of chemical composition and infusion colour difference analysis to quality estimation of jasmine-scented tea.International Journal of Food Science and Technology.2007(42):459-468.

9 傅若農(nóng).固相微萃取(SPME)的演變和現(xiàn)狀.化學(xué)試劑，2008(1):13-22.

10 葉乃興，楊廣，鄭乃輝，等.濕窨工藝及配花量對(duì)茉莉花茶香氣成分的影響.茶葉科學(xué)，2005，1(26):65-71.

11 楊江帆，楊廣，梁小蝦，等.茉莉花茶香氣的SPME/GC-MS檢測(cè)方法.熱帶作物學(xué)報(bào)，2009，30(11):1698-1705.

12 施夢(mèng)南，唐德松，龔淑英，等.SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析茉莉花茶的揮發(fā)性成分.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13(6):234-239.

13 Lin J，Chen Y，Zhang P，et al.A novel quality evaluation index and strategies to identify scenting quality of jasmine tea based on headspace volatiles analysis. Food Science and Biotechnology，2013，22(2):331-340.

14 邊金霖.產(chǎn)地與加工過程中綠茶香氣物質(zhì)的變化規(guī)律研究.杭州:浙江大學(xué)，2012:碩士.

15 林杰.茶葉香氣的圖譜分析及在茶葉品質(zhì)真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用.杭州:浙江大學(xué)，2012:博士.

16 周珊，趙立文，馬騰蛟，等.固相微萃取(SPME)技術(shù)基本理論及應(yīng)用進(jìn)展.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2006(2):86-90.

17 代毅.龍井茶特征香氣成分的研究.杭州:浙江大學(xué)，2008:碩士.

18 馬軍輝.HS-SPME-GC-MS檢測(cè)茶葉內(nèi)揮發(fā)性組分方法的建立及應(yīng)用.杭州:浙江大學(xué)，2008:碩士.

19 劉曉慧，張麗霞，王日為，等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析黃茶香氣成分.食品科學(xué)，2010(16):239-243.

20 曹艷妮.不同儲(chǔ)存時(shí)間普洱茶的理化分析和抗氧化性研究.廣州:華南理工大學(xué)，2011:碩士.

21 施元旭.茶葉揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫的建立與應(yīng)用研究.2015:碩士.