RP—HPLC法測定腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中維生素A棕櫚酸酯的含量

莫鳴

[摘要]目的 采用石油醚（沸程60～90℃）作為溶劑建立萃取腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）中維生素A棕櫚酸酯的方法，并利用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定其含量。 方法 使用沸程60～90℃的石油醚與腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑乳化后加入乙醇破乳，萃取出維生素A棕櫚酸酯。以Thermo C18 （Hypersil ODS）柱（5 ?m，4.0mm×250mm）為色譜柱，以甲醇︰水（97︰3，V/V）為流動相，泵流速為2.0mL/min，檢測波長為325nm，采用RP-HPLC外標法測定維生素A棕櫚酸酯含量。 結果 維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0?g/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.9992），其精密度相對標準偏差（RSD）為2.0%（n=12）；回收率為99.51%，回收率RSD為1.2%（n=6）。 結論 RP-HPLC法簡便、快速、準確、精密度好且無干擾，可用于腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中維生素A棕櫚酸酯含量測定。

[關鍵詞] 反相高效液相色譜法；腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑；維生素A棕櫚酸酯；萃取

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）19-65-05

[Abstract] Objective To establish a method for extracting vitamin A palmitate from enteral nutrition emulsion （TP） using petroleum ether （boiling range from 60 to 90℃） as a solvent， and the concentration of vitamin A palmitate was determined using reverse phase high performance liquid chromatography（RP–HPLC）. Methods The enteral nutrition emulsion was emulsified with petroleum ether， and then demulsified with ethanol for extraction of vitamin A palmitate. The concentration of vitamin A palmitate was determined using RP-HPLC external standard method on a Thermo C18 （Hypersil ODS） column（5?m， 4.0mm×250mm）at 325 nm with a mobile phase of methanol/water （97︰3， V/V）， and a flow velocity of 2.0mL/min. Results A satisfactory linear relationship was observed when the vitamin A palmitate concentration ranged from 1.0 to 10.0 ?g/mL（r=0.9992）， and the relative standard deviation （RSD） of precision was 2.0%（n=12）. The mean recovery rate was 99.51%， with its RSD of 1.2%（n=6）. Conclusion RP-HPLC is a simple， rapid and accurate method with a high precision， which can be used for the determination of vitamin A palmitate concentration in enteral nutrition emulsion.

[Key words] Reverse phase high performance liquid chromatography （RP–HPLC）； Enteral nutrition emulsion； Vitamin A palmitate； Extraction

腸內(nèi)營養(yǎng)（EN）給藥是經(jīng)口服或管飼提供滿足或補充代謝需要的營養(yǎng)基質(zhì)及其他各種營養(yǎng)素的營養(yǎng)支持方式[1-2]。近年來，營養(yǎng)支持尤其是腸內(nèi)營養(yǎng)支持在各種危重患者的臨床應用中愈加受到重視[3-5]。腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）含蛋白質(zhì)、多種水溶性維生素、脂溶性維生素及多種微量元素，其中維生素A就是其中重要的脂溶性維生素之一。通常采用紫外三點校正法測定維生素A含量[6-7]；但復方制劑中由于成分復雜、相互干擾，紫外分光光度法因?qū)傩圆疃鵁o法對復方制劑中的維生素A進行檢測。既往研究顯示，可應用固相萃取高效液相色譜法（HPLC）測定魚肝油乳中維生素A含量[8-10]。但腸內(nèi)營養(yǎng)制劑中富含蛋白質(zhì)，無法固相萃取其中的維生素A。本研究建立了以石油醚（沸程60～90 ℃）為溶劑的萃取法，并利用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）中的維生素A棕櫚酸酯含量，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

維生素A棕櫚酸酯對照品購自DSM公司（批號為0000018484，含量為1832946IU/g）；腸內(nèi)營養(yǎng)液由華瑞制藥有限公司提供，商品名瑞素（國藥準字：H20020588，批號：80BF105），其處方見表1。甲醇，色譜純，購自Merck公司；石油醚（沸程：60～90℃），分析純，為國藥集團產(chǎn)品；無水乙醇，分析純，購自國藥集團。1100型高效液相色譜儀及其化學工作站購自Agilent公司。

1.2 RP-HPLC測定方法

1.2.1 流動相和色譜條件 選擇Thermo Hypersil ODS C18柱（5 ?m，4.0mm×250mm）為色譜柱，以甲醇︰水（97︰3，V/V）為流動相，泵流速為2.0mL/min，檢測波長為325nm，進樣量為20 ?L。endprint

1.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取維生素A棕櫚酸酯對照品15mg，置100mL量瓶中，加石油醚溶解并稀釋至刻度。精密量取1mL置100mL量瓶中，加石油醚稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制 精密稱取瑞素樣品20g（密度為1.068g/mL），加入20mL石油醚中劇烈振搖5min，加入40mL無水乙醇，再振搖3min，放置分層。取上清液為樣品溶液。

1.2.4 維生素A棕櫚酸酯含量測定 分別取對照品溶液和供試品溶液各20?L，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算獲得維生素A棕櫚酸酯含量[11-12]。

1.2.5 系統(tǒng)適應性試驗 取樣品溶液進樣20?L，在325nm處測定，理論塔板數(shù)為5327，說明柱效較高，完全能滿足本次實驗。利用二極管陣列檢測器和化學工作站，測定維生素A棕櫚酸酯的峰純因子為999.930，說明此峰中無其他未分離組分（圖1）。

1.2.6 專屬性試驗 配制不含維生素A棕櫚酸酯的陰性樣品溶液，同時進樣此樣品溶液和1.2.2中制備的標準對照品溶液，樣品溶液在維生素A棕櫚酸酯處不出峰（圖2）。

1.2.7 線性試驗 精密稱取維生素A棕櫚酸酯10、15、25、50、100mg，用石油醚（沸程為60～90℃）分別溶解并制成1.00、1.50、2.50、5.00、10.00 ?g/mL溶液，取20 ?L進樣，每份進樣2次，以濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標計算回歸方程及相關系數(shù)（r）。

1.2.8 重復性試驗 按1.2.3方法制備6份樣品溶液，取樣品溶液20?L進樣，計算樣品溶液中維生素A棕櫚酸酯峰面積與樣品稱重比值的相對標準偏差（RSD）。

1.2.9 中間精密度試驗 采用另外一臺Agilent 1100型高效液相色譜儀，按上述方法測定6次，計算樣品中維生素A棕櫚酸酯峰面積與樣品稱重比值的RSD值。

1.2.10 回收率試驗 稱取維生素A棕櫚酸酯16.5527mg，按1.2.2方法配制標準溶液，精密稱定已知含量的瑞素6份各20g，分別加入20.00mL標準溶液，劇烈振搖5min，加入40.0mL無水乙醇，再振搖3min，取上清液進樣，計算回收率。

2 結果

以濃度C為橫坐標、峰面積A為縱坐標，計算得到線性回歸方程為A=42.9971C-1.2916，相關系數(shù)r=0.9992（表2），表明維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0?g/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好。其重復性和中間精密度試驗的RSD為2.0%（n=12），表明重復性和中間精密度好（表3～4）。樣品回收率為99.51%，回收率RSD=1.2%（表5），表明此方法結果準確。通過陰性樣品試驗和峰純度檢查說明本方法專屬性較好（圖1～2）。

3 討論

腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）為復方制劑，成分復雜、干擾較多，測定時我們先使用石油醚對樣品充分乳化，使得維生素A棕櫚酸酯酯充分分散到石油醚中，然后使用乙醇作為破乳劑將樣品充分震搖而產(chǎn)生破乳，最終使石油醚層與乙醇層迅速分離。對于破乳劑應先確定其是油溶性還是水溶性，水溶性破乳劑用水作為溶劑，油溶性破乳劑通常用甲醇作為溶劑，考慮到甲醇的毒性，采用無毒乙醇作為替代品，收到了良好效果[13-14]。

石油醚的沸程有30～60℃、60～90℃和90～120℃，此數(shù)值是指餾分不同，30～60℃沸程是指其中餾分的初餾點不低于30℃，終餾點不高于60℃，其他依此類推。因此，30～60℃沸程的石油醚最容易揮發(fā)，60～90℃次之，90～120℃相對不易揮發(fā)，但與樣品的乳化能力稍差[15]。我們采取60～90℃沸程的石油醚，其不易揮發(fā)，又有較強和樣品充分乳化的能力，能更好地萃取，故選擇其作為萃取溶劑。

使用石油醚溶解維生素A棕櫚酸酯在紫外分光光度計中掃描，測得其最大吸收波長為325nm[13]，故本實驗采用325nm作為檢測波長。樣品取樣采用稱重而不是體積是為了取樣更準確。因為腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑富含蛋白質(zhì)和脂肪，有一定黏稠度，量取體積會增加實驗誤差。此外，對照品和樣品溶液制備時要盡量避光或在暗光下操作，雖然維生素A棕櫚酸酯的穩(wěn)定性較醋酸酯高，但制備好的溶液仍盡可能快速進樣分析，以防維生素A棕櫚酸酯在溶液中降解[16]。

本研究建立并應用RP-HPLC法測定腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中的維生素A棕櫚酸酯含量，發(fā)現(xiàn)維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0?g/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.9992），重復性和中間精密度較高（RSD=2.0%）；測定結果準確，樣品回收率為99.51%，回收率RSD=1.2%；且專屬性較好。本研究結果表明，RP-HPLC法簡便、快速、準確、精密度好且無干擾，可用于腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中維生素A棕櫚酸酯含量測定。

[參考文獻]

[1] 李彥芹.腸內(nèi)營養(yǎng)制劑的特點和應用選擇[J].臨床藥物治療雜志，2009，7（6）：33-36.

[2] Seres DS，Valcarcel M，Guillaume A. Advantages of enteral nutrition over parenteral nutrition[J].Therap Adv Gastroenterol，2013，6（2）：157-167.

[3] Tucker A， Ybarra J， Bingham A， et al.American society for parenteral and enteral nutrition （a.s.p.e.N.） standards of practice for nutrition support pharmacists[J].Nutr Clin Pract，2015，30（1）：139-146.endprint

[4] Durfee SM，Adams SC，Arthur E，et al.A.S.P.E.N. Standards for Nutrition Support：Home and Alternate Site Care[J].Nutr Clin Pract，2014，29（4）：542-555.

[5] Brantley SL，Russell MK，Mogensen KM，et al.American Society for Parenteral and Enteral Nutrition and Academy of Nutrition and Dietetics： revised 2014 standards of practice and standards of professional performance for registered dietitian nutritionists （competent， proficient， and expert） in nutrition support[J].Nutr Clin Pract，2014，29（6）：792-828.

[6] 錢玲慧，廖佳宇，李亞妮，等.測定維生素A的三種方法比較[J].實驗技術與管理，2012，29（5）：43-48.

[7] 劉文英.藥物分析[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：208-214.

[8] 胡漳程.HPLC法測定三維魚肝油乳中的維生素A含量[J].海峽藥學，2009，21（8）：68-69.

[9] 陳詠，樓永明.固相萃取-HPLC法測定魚肝油乳中維生素A的含量[J].海峽藥學，2009，21（4）：64-65.

[10] 胡少卿.高效液相色譜法測定魚肝油乳劑中維生素A的含量[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（20）：101-102.

[11] 蘇佳妍，岳青陽，于大海，等.維生素A含量測定方法研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2010，39（6）：557-558.

[12] 譚青松，付潔，何瑞國.高效液相色譜法測定魚樣中的維生素A、維生素D3和維生素E[J].動物營養(yǎng)學報，2007，19（5）：636-640.

[13] 夏敬云，任春梅，付會兵，等.維生素A棕櫚酸酯的分離純化與分析[J].基因組學與應用生物學，2013，32（1）：70-75.

[14] 韓創(chuàng)輝，閆強偉，劉貴賓.破乳劑的室內(nèi)評選結果準確度的探討[J].化學工程與裝備，2013，42（6）：106-108.

[15] 金曉林， 魏濤.以石油醚替代苯測定糧食脂肪酸值的研究[J].糧油倉儲科技通訊，2003，19（1）：48-49.

[16] 劉祥洪，連明，覃廣德.一步法合成維生素A棕櫚酸酯[J].廣州化工，2011，39（14）：63-64.

（收稿日期：2015-05-14）endprint