扎考比利對(duì)大鼠離體冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及其機(jī)制

劉成芳，王瑾，劉宇，和榮麗，張衛(wèi)國(guó)，牛龍剛，吳博威

扎考比利對(duì)大鼠離體冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張作用及其機(jī)制

劉成芳，王瑾，劉宇，和榮麗，張衛(wèi)國(guó)，牛龍剛，吳博威

目的：研究扎考比利（zacopride） 舒張大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)的作用及其可能機(jī)制。

方法：雄性SD大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)的張力舒縮狀態(tài)采用PowerLab和DMT系統(tǒng)記錄，SD大鼠隨機(jī)分為4組，內(nèi)皮完整[+Endo, +Endo（vehicle）]組、+Endo（zacopride）組、完全去除內(nèi)皮[-Endo, -Endo（vehicle）]組和-Endo（zacopride）組，每組6只大鼠，觀察zacopride對(duì)KCl、血管收縮劑血栓素A2類似物（U46619）預(yù)收縮離體大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張作用；研究不同作用類藥物對(duì)zacopride舒張血管作用的影響。

結(jié)果：在+Endo（zacopride）組和-Endo（zacopride）組，Zacopride對(duì) KCl（60 mmol/L）和 U46619 （10-6mol/L）預(yù)收縮的冠狀動(dòng)脈環(huán)呈現(xiàn)濃度依賴性地舒張作用，+Endo（zacopride）組Zacopride 對(duì) KCl 和 U46619 預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈的最大舒張幅度分別為（90.15±6.38）% 和（81.67±4.97）%，-Endo（zacopride）組 zacopride 對(duì) KCl 和 U46619預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈的最大舒張幅度分別為（85.48±5.04）% 和（79.65±3.51）%，兩組zacopride 對(duì) KCl 和 U46619 預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈的最大舒張幅度都顯著高于其+Endo（vehicle）組和-Endo（vehicle）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；內(nèi)向整流鉀通道（IK1）阻斷劑 BaCl2明顯減弱 zacopride 的舒張血管作用，使zacopride對(duì) KCl 和U46619 預(yù)收縮動(dòng)脈環(huán)的最大舒張幅度均減小 （P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而一氧化氮合酶抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）、鈣激活鉀通道阻斷劑四乙胺（TEA）、三磷酸腺苷敏感性鉀通道阻斷劑格列苯脲（Glib）和電壓依賴性鉀通道阻斷劑 4-氨基吡啶（4-AP）對(duì) zacopride 的舒張血管作用沒(méi)有明顯影響（P均＞ 0.05）。

結(jié)論：Zacopride 對(duì) KCl 和 U46619預(yù)收縮大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)有明顯的舒張作用；Zacopride對(duì)冠狀動(dòng)脈的舒張作用與激動(dòng)IK1通道有關(guān)。

扎考比利；冠狀動(dòng)脈；血管舒張；內(nèi)向整流鉀通道

Objective: To investigate the effect with its possible mechanisms of zacopride on vasodilatation of isolated coronary arterial rings in experimental rats.

Methods: The tension of vasodilatation of isolated coronary arterial rings of male SD rats was recorded by Powerlab and DMT system. The rats were divided into 4 groups: +Endo (vehicle) group, +Endo (zacopride) group and -Endo (vehicle) group, –Endo (zacopride) group. n=6 in each group. The vasodilatation effects of zacopride on KCl (60 mmol/L) and U46619 (10-6mol/L) pre-constricted arterial ring were recorded; the effects of different agents on zacopride caused vasodilatation were studied.

Results: In both +Endo (zacopride) and –Endo (zacopride) groups, zacopride showed a dose dependent vasodilatation effect on coronary ring pre-constricted by KCl and U46619. The maximum vasodilatation effect of zacopride in KCl treated +Endo (zacopride) group was (90.15 ± 6.38) %, in U46619 treated-Endo (zacopride) group was (81.67 ± 4.97 ) %; themaximum vasodilatation effect of zacopride in KCl treated-Endo (zacopride) group was (85.48±5.04) %, in U46619 treated–Endo (zacopride) group was (79.65 ± 3.51) %, compared to each corresponding vehicle group, all P＜0.05. The inhibitor of IK1 channel, BaCl2could signifcantly reduce the vasodilatation effect of zacopride in KCl and U46619 pre-constricted coronary ring, P＜0.05. However, the inhibitor of eNOS (L-NAME), the blocker of KCachannel (TEA), blocker of Kv channel (4-AP) and blocker of KATP channel (Glib) had no such signifcant effects, all P＞0.05.

Conclusion: Zacopride had vasodilatation effect on coronary arterial ring which was pre-constricted by KCl and U46619, which might be related to the channel of IK1.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1212.)

扎考比利（zacopride），屬于苯甲酰胺衍生物，為5-HT4受體激動(dòng)劑和5-HT3受體阻斷劑，是一種全胃腸動(dòng)力藥[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者還發(fā)現(xiàn)zacopride具有促進(jìn)呼吸、止吐和抗焦慮等作用[2-4]。在心血管方面的研究中，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了zacopride對(duì)大鼠心室肌內(nèi)向整流鉀通道 （IK1）具有顯著的激動(dòng)作用，并且zacopride通過(guò)激動(dòng)IK1可以抑制觸發(fā)性心律失常和缺血性心律失常[5-7]。Liao等[8]和Wu等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Zacopride可加強(qiáng)缺血后適應(yīng)和減輕離體心臟的缺血/再灌注損傷，這些研究從不同側(cè)面觀察到zacopride對(duì)心臟損傷的保護(hù)作用。但關(guān)于zacopride對(duì)冠狀動(dòng)脈的作用還少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究擬通過(guò)離體血管張力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀察zacopride對(duì)成年大鼠離體冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張作用，并分析其可能的舒張機(jī)理。

1　材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 清潔級(jí)雄性 SD 大鼠，體重 240～260 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK( 晉) 2009-0001。

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器: Zacopride hydrochloride，購(gòu)于英國(guó)Tocris公司；苯腎上腺素（PE）、乙酰膽堿（Ach）、左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、4-氨基吡啶（4-AP）、格列苯脲（Glib）、四乙胺（TEA）和血栓素A類似物（U46619）均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；其余試劑為市售分析純。HEPES緩沖液的成分及其濃度（mmol/L）如下：NaCl：144，KCl：5.8，MgCl2：1.2，CaCl2：2.5，葡萄糖：11.1，HEPES：5，pH=7.38。610 M多通道血管張力測(cè)定儀（Multi Myograph System-610M）丹麥 DMT 公司；Powerlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng) 澳大利亞埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司。

離體冠狀動(dòng)脈環(huán)的制備: SD大鼠脫臼處死后，立即取出心臟，浸入4℃，pH= 7.38 的 HEPES 液中。鈍性分離大鼠冠狀動(dòng)脈，在前降支處剪取 2 mm 的血管環(huán)。將分離干凈的冠狀動(dòng)脈環(huán)穿入兩根直徑為40 μm 的鎢絲，然后將血管環(huán)固定在血管張力測(cè)定儀浴槽內(nèi)傳感器上。浴槽內(nèi)持續(xù)通以 95 % O2和 5% CO2的混合氣體，溫度恒定為 37℃。動(dòng)脈環(huán)平衡 90 min 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，平衡期間每隔 15～20 min 更換浴槽內(nèi) HEPES 一次。冠狀動(dòng)脈環(huán)的張力變化通過(guò) DMT的換能系統(tǒng)采集，并用 Chart5.5記錄在計(jì)算機(jī)上。

血管環(huán)活性檢測(cè): 冠狀動(dòng)脈環(huán)在 HEPES 液內(nèi)平衡 90 min 后，用 60 mmol/L KCl 收縮動(dòng)脈環(huán) 3 次， 當(dāng) 3次的收縮幅度相差不超過(guò) 10% 時(shí)，則認(rèn)為冠狀動(dòng)脈環(huán)反應(yīng)良好。選取收縮張力達(dá)到 2 mN以上并且收縮平臺(tái)穩(wěn)定的血管環(huán)進(jìn)行zacopride舒張實(shí)驗(yàn)的研究。

冠狀動(dòng)脈環(huán)的去內(nèi)皮: 用 10-6mol/L PE 預(yù)收縮反應(yīng)良好的冠狀動(dòng)脈環(huán)，收縮穩(wěn)定后加入10-5mol/L Ach 檢驗(yàn)血管內(nèi)皮的完整性，若加Ach 后使 PE 預(yù)收縮的血管舒張大于 90%，認(rèn)為內(nèi)皮完整（+Endo）；用比冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑稍細(xì)的細(xì)管插入冠狀動(dòng)脈內(nèi)，然后向其內(nèi)溫和的打入氣泡，連續(xù)幾次后，即可將冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮機(jī)械性地去除掉[10]，隨后用 10-6mol/L PE 預(yù)收縮，再加入10-5mol/L Ach，當(dāng) Ach 不產(chǎn)生舒張作用或舒張幅度小于預(yù)收縮的 10%時(shí)，認(rèn)為已完全去除內(nèi)皮（-Endo）。

Zacopride 對(duì) KCl 或 U46619 預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張作用：SD大鼠隨機(jī)分為4組：+Endo（vehicle）組、+Endo（zacopride）組、-Endo（vehicle）組和-Endo（zacopride）組，每組6只大鼠。用 60 mmol/L KCl 或10-6mol/L U46619（浴槽內(nèi)終濃度）預(yù)收縮每組大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)達(dá)平臺(tái)后，采用累積加藥的方法，+Endo（zacopride）和-Endo（zacopride）組依次加入不同濃度的 zacopride（10-6，10-5.5、10-5、10-4.5、10-4mol/L）舒張冠狀動(dòng)脈環(huán)，當(dāng)前一濃度舒張血管達(dá)平臺(tái)后再加入后一濃度，+Endo(vehicle)和-Endo（vehicle）組分別加入與zacopride等容量等摩爾濃度的 NaCl。以60 mmol/L KCl 或10-6mol/L U46619 所致冠狀動(dòng)脈環(huán)收縮的最大幅度為 100%，計(jì)算各個(gè)濃度 zacopride對(duì)冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張百分比。

鉀通道阻斷劑和一氧化氮合酶抑制劑對(duì)zacopride 舒張大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)作用的影響：實(shí)驗(yàn)分為 6 組，設(shè)對(duì)照組，每組 6 只大鼠，用 60 mmol/L KCl 或 10-6mol/L U46619 預(yù)收縮內(nèi)皮完整冠狀動(dòng)脈環(huán)達(dá)平臺(tái)后，分別加入鈣激活鉀通道（KCa）阻斷劑TEA（10-2mol/L）為TEA+zacopride組、IK1阻斷劑 BaCl2（10-4mol/L）為BaCl2+zacopride組、三磷酸腺苷敏感性鉀通道（KATP）阻斷劑 Glib（10-5mol/L）為Glib+zacopride組、電壓依賴性鉀通道（KV）阻斷劑 4-AP（10-3mol/L）為4-AP+zacopride組及一氧化氮合酶抑制劑 L-NAME（10-4mol/L）為L(zhǎng)-NAME+zacopride組，對(duì)照組加入等容量等摩爾濃度的NaCl。孵育約 10 min 后冠狀動(dòng)脈環(huán)再達(dá)平臺(tái)，各組累積加入濃度梯度的 zacopride（10-6，

10-5.5、10-5、10-4.5、10-4mol/L），以 60 mmol /L KCl或 10-6mol/L U46619 收縮達(dá)平臺(tái)時(shí)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算不同作用類藥物在各個(gè)濃度 zacopride 對(duì)冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張百分比數(shù)。

2　結(jié)果

不同濃度zacopride對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)發(fā)生濃度依賴性的舒張作用（表1）：在+Endo（zacopride）組和-Endo（zacopride）組，zacopride 對(duì) 60 mmol/L KCl 和10-6mol/L U46619 預(yù)收縮大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)的最大舒張幅度分別為（90.15±6.38） % 、（81.67±4.97）%及（85.48±5.04）%、（79.65±3.51）%，均顯著高于對(duì)應(yīng)的+Endo（vehicle）組和-Endo（vehicle）組（P均＜ 0.05）。+Endo（zacopride）組和-Endo（zacopride）組之間對(duì) 60 mmol/L KCl 和 10-6mol/L U46619預(yù)收縮大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)的最大舒張幅度差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

鉀通道阻斷劑和一氧化氮合酶抑制劑對(duì)zacopride 舒張大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)的干預(yù)作用（表2）：在60 mmol/L KCl 或 10-6mol/L U46619 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整冠狀動(dòng)脈環(huán)上，BaCl2+zacopride組（10-4.5～10-4mol/L）對(duì) KCl 、U46619預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈環(huán)的最大舒張幅度均明顯低于其對(duì)照組（P均＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4-AP、TEA、Glib 和 L-NAME 均沒(méi)有顯著影響zacopride 對(duì)冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張作用（P＞0.05）。

表1　不同濃度zacopride 對(duì) KCl 、U46619預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張百分比（%，

表1　不同濃度zacopride 對(duì) KCl 、U46619預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈環(huán)的舒張百分比（%，

注：U46619：血管收縮劑血栓素A2類似物；zacopride：扎考比利； +Endo(Vehicle)組：內(nèi)皮完整對(duì)照組；-Endo(Vehicle)組：去內(nèi)皮對(duì)照組；+Endo (zacopride)組：內(nèi)皮完整扎考比利組；-Endo (zacopride)組：去內(nèi)皮扎考比利組。與+Endo(vehicle)組相比*P＜0.05；與-Endo(vehicle)組比△P＜ 0.05

?

表2　四組中各藥物在不同濃度 zacopride 舒張KCl、 U46619預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈環(huán)中的作用舒張百分比

表2　四組中各藥物在不同濃度 zacopride 舒張KCl、 U46619預(yù)收縮冠狀動(dòng)脈環(huán)中的作用舒張百分比

注：TEA：四乙胺；Glib：格列苯脲； 4-AP：4-氨基吡啶 ；L-NAME：左旋硝基精氨酸甲酯。與對(duì)照組相比*P＜0.05。 余注見(jiàn)表1

?

3　討論

在 IK1激動(dòng)劑的研究中發(fā)現(xiàn)，氟卡尼，嗎啡和一氧化氮（NO）等藥物有增強(qiáng) IK1的作用，但都表現(xiàn)為非特異性[11，12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了首個(gè)IK1選擇性激動(dòng)劑 zacopride，其對(duì)大鼠心室肌IK1表現(xiàn)出特異性的激動(dòng)作用，其對(duì)大鼠心室肌 IK1的內(nèi)向電流和外向電流都有增強(qiáng)效應(yīng)，而對(duì) L-型Ca電流（ICa-L）、鈉電流（INa）、鈉鈣交換電流（INa/Ca）、持續(xù)外向延遲整流鉀電流（Isus）、瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）和鈉鉀泵電流（Ipump）等其它影響動(dòng)作電位的主要離子電流均無(wú)顯著作用[7]。構(gòu)成 IK1通道的亞單位主要來(lái)自 Kir2 亞家族（Kir2.x）中的 Kir2.1、Kir2.2和 Kir2.3，Wang 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，Kir2.1通道是IK1的主要亞型，所介導(dǎo)的電流占總 IK1電流的80%以上。我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，zacopride對(duì)大鼠心肌IK1的激動(dòng)作用是經(jīng) Kir2.1介導(dǎo)的, 而與 Kir2.2 和Kir2.3無(wú)關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌上 IK1亞基主要是 Kir2.1的表達(dá)，無(wú) Kir2.2 和 Kir2.3 的表達(dá)[15]，這提示我們 zacopride 可能通過(guò)激動(dòng)血管平滑肌上的IK1來(lái)發(fā)揮舒張冠狀動(dòng)脈的作用，這是本研究的主要目標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，無(wú)論離體動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)皮是否完整，zacopride都可以濃度依賴性地舒張由KCl和U46619預(yù)收縮的大鼠冠狀動(dòng)脈，并且L-NAME沒(méi)有影響zacopride的舒張血管作用，說(shuō)明zacopride的舒張血管作用是不依賴于血管內(nèi)皮的，這提示zacopride可能直接作用于血管平滑肌而使冠狀動(dòng)脈舒張。而鉀通道是選擇性允許 K+跨膜通過(guò)的離子通道，在調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮活動(dòng)中具有重要作用。激活血管平滑肌上的鉀通道，能引起細(xì)胞膜超級(jí)化，從而抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流，引起平滑肌舒張[16]。血管平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)四種類型的鉀通道： KCa、IK1、KATP和KV，本實(shí)驗(yàn)觀察到，IK1激動(dòng)劑zacopride濃度依賴性地舒張大鼠冠狀動(dòng)脈環(huán)，并且IK1阻斷劑BaCl2明顯減弱zacopride的舒張血管作用，而KCa阻斷劑TEA、KATP阻斷劑Glib和KV阻斷劑4-AP對(duì)zacopride的舒張血管作用沒(méi)有明顯影響，這進(jìn)一步證實(shí)了zacopride對(duì)IK1的選擇性激動(dòng)作用，并且可以明顯地舒張血管，這將為zacopride在心血管方面的開(kāi)發(fā)利用提供進(jìn)一步的參考價(jià)值。

[1] Costall B, Domeney AM, Gerrard PA, et al. Zacopride: anxiolytic profile in rodent and Primate models of anxiety. Pharm Pharmacol 1988, 40: 302-305

[2] Yamakuni H, Nakayama H, Matsui S, et al. Inhibitory effect of zacopride on cisplatin-induced delayed emesis in ferrets. J Pharmacol Sci. 2006, 101: 99-102.

[3] Meyer LC, Fuller A, Mitchell D. Zacopride and 8-OH-DPAT reverse opioid-induced respiratory depression and hypoxia but not catatonic immobilization in goats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2006, 290: R405-413.

[4] Xin W, Olga D, Harriet K, et al. 5-Hydroxytryptamine 1A/7 and 4 receptors differentially prevent opioid-induced inhibition of brain stem cardiorespiratory function. Hypertension, 2007, 50: 368-376.

[5] 劉清華, 吳博威, 張楊, 等．Zacopride增強(qiáng)心肌內(nèi)向整流鉀電流(IK1)發(fā)揮抗心律失常效應(yīng). 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26: 1041-1046.

[6] 劉清華, 張楊, 林媛媛, 等. 5-HT4受體激動(dòng)劑兼5-HT3 受體阻斷劑2-1-(4-Piperonyl)piperazinyl]-benzothiazole致心律失常機(jī)制探析. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26: 461-465.

[7] QH Liu, XL Li, YW Xu, et al. A novel discovery of IK1channel agonist: zacopride selectively enhances ik1 current and suppresses triggered arrhythmias in the rat. J Cardiovasc Pharmacol, 2012, 59: 37-48.

[8] Liao Z, Feng Z, and Long C. Agonist of inward rectifier K+ channels enhances the protection of ischemic postconditioning in isolated rat hearts. Perfusion, 2014, 29: 321-326.

[9] Wu B, Long C, Hei F, et al. The protective effect of St. Thomas cardioplegia enriched with zacopride on the isolated rat heart. Artif Organs, 2013, 37: E44-50.

[10] Liu Y, Harder DR, Lombard JH. Myogenic activation of canine small renal arteries after nonchemical removal of the endothelium. Am J of Physiol Heart and Cir Physiol, 1994, 267: H302-H307.

[11] Xiao GS, Zhou JJ, Wang GY, et al. In vitro electrophysiologic effects of morphine in rabbit ventricular myocytes. Anesthesiology, 2005, 103: 280-286.

[12] Gomez R, Caballero R, Barana A, et al. Nitric oxide increases cardiac IK1 by nitrosylation of cysteine 76 of Kir2. 1 channels. Circ Res, 2009, 105: 383-392.

[13] Wang Z, Yue L, White M, et al. Differential distribution of inward rectifier potassium channel transcripts in human atrium versus ventricle. Circulation, 1998, 98: 2422-2428.

[14] Zhang L, Liu Q, Liu C, et al. Zacopride selectively activates the Kir2. 1 channel via a PKA signaling pathway in rat cardiomyocytes. Sci China Life Sci, 2013, 56: 788-796.

[15] 張樂(lè)之, 開(kāi)麗, 譚婭. 平滑肌內(nèi)向整流鉀通道(KIR). 生命科學(xué)研究. 2002, 6: 70-73.

[16] 李寧, 王雄. 利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機(jī)制研究. 中國(guó)循環(huán)雜志. 2015, 30: 50-53.

（編輯：常文靜）

Effect and Mechanism of Zacopride on Vasodilatation of Isolated Coronary Arterial Rings in Experimental Rats

LIU Cheng-fang, WANG Jin, LIU Yu, HE Rong-li, ZHANG Wei-guo, NIU Long-gang, WU Bo-wei.
Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China
Corresponding Author: WU Bo-wei, Email: qwaesd299@163.com

Zacopride; Coronary artery; Vasodilatation; Inwardly-rectifying potassium Channels

山西省自然科學(xué)基金（2015021177）；山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金（03201405）；山西醫(yī)科大學(xué)青年基金（Q02201205）；

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院331培植項(xiàng)目（201208）

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)教研室

劉成芳 講師 博士 研究方向?yàn)樾穆墒С?、心血管重?gòu) Email：ljjlcf@ @126.com 通訊作者：吳博威 Email：qwaesd299@163.com

R54

A

1000-3614（2015）12-1212-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.12.019

（2015-03-18）