球孢白僵菌在玉米中的定殖研究*

魏世譽(yù)，王 娟，隋 麗，李啟云，張正坤，張佳詩，路 楊，趙 宇，張延明，徐文靜＊＊

(1．哈爾濱師范大學(xué);2．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;3．東北農(nóng)業(yè)大學(xué))

0 引言

玉米是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，其種植面積僅次于小麥和水稻．玉米的用途十分廣泛，可作為人們廉價(jià)的裹腹之物，也可作為飼料以及工業(yè)原料，其中飼料消費(fèi)是玉米最重要的消費(fèi)渠道，約占消費(fèi)總量的70%左右，工業(yè)原料使用也是玉米消費(fèi)的主要渠道．因此，其產(chǎn)量的高低直接關(guān)系到國家糧食生產(chǎn)安全和農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入，但是，由于多年重茬種植及全球氣候變化異常等因素的影響，導(dǎo)致害蟲在玉米田間的危害更加嚴(yán)重．玉米螟是我國玉米生產(chǎn)中最突出的害蟲之一，它可在玉米的不同生育期進(jìn)行危害，降低玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重制約了玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展．

近年來隨著對(duì)白僵菌生態(tài)習(xí)性的研究，發(fā)現(xiàn)其部分種類屬于植物內(nèi)生菌，并在植物的促生抗蟲中發(fā)揮了重要的作用．

1 白僵菌的生物學(xué)特性與致病機(jī)理

白僵菌是一種蟲生真菌，屬半知菌亞門(Deteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomy-cetales)、叢梗孢科(Moniliaceac)、白僵菌屬(Beauveria)［1］．其中球孢白僵菌和卵孢白僵菌隸屬白僵菌屬，常被用于生物防治．該實(shí)驗(yàn)以球孢白僵菌為實(shí)驗(yàn)菌株．球孢白僵菌的殺蟲機(jī)理不同于化學(xué)殺蟲劑．球孢白僵菌是將分生孢子以粉狀或霧狀的形態(tài)與蟲體相接觸，經(jīng)昆蟲呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)直接進(jìn)入蟲體，在適宜的溫濕度條件下孢子萌發(fā)芽管，其分泌的幾丁質(zhì)酶可溶解害蟲體表的幾丁質(zhì)，破壞蟲體保護(hù)屏障．同時(shí)球孢白僵菌吸收蟲體營養(yǎng)，并產(chǎn)生毒素，最終致使蟲體死亡［2］．

2 球孢白僵菌防治玉米螟的應(yīng)用現(xiàn)狀

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)防治玉米螟(Osirinia furnacalis)的效果早已得到肯定，但施菌技術(shù)限制著球孢白僵菌在田間的推廣及應(yīng)用［3］，尤其是在劑型選擇方面．顆粒劑可對(duì)玉米心葉定向施藥，針對(duì)性強(qiáng);懸乳劑和油懸劑的可操作性強(qiáng)，毒力測(cè)定效果好于顆粒劑，但在田間采用噴霧器施藥時(shí)，無法準(zhǔn)確定位蟲體所在部位，藥效會(huì)有所降低;粉劑噴粉功效雖高，但粉塵污染較嚴(yán)重［4］．該研究利用球孢白僵菌的植物內(nèi)生性，將其定殖在玉米中，旨在明確球孢白僵菌同其他生防菌相比是否具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也將為多渠道開發(fā)利用球孢白僵菌提供新的科學(xué)數(shù)據(jù)．

3 材料與方法

3．1 材料

(1)供試菌粉、種子及土壤

供試菌株為球孢白僵菌高孢粉，從吉林省農(nóng)院生物制劑廠采購，含孢量≥1000億孢子/g，孢子萌發(fā)率≥90%，含水量5% ～10%．

供試種子為墾粘1號(hào)玉米，從吉林省公主嶺市種子市場采購．

土壤取自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)菜園土，去除石子和雜草后過篩．

(2)培養(yǎng)基及其成分

PPDA篩選培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、瓊脂 9 g、蛋白胨 5 g、去離子水 1000 mL、125 mg/L頭孢霉素、138 mg/L硫酸卡納霉素、70 mg/L多果定．

3．2 方法

(1)孢子懸液的制備

取1 g球孢白僵菌高孢粉加入100 mL含0．1%的Tween-80無菌水中，用玻璃珠在搖床上震蕩打散，稀釋100倍，顯微鏡下計(jì)算孢子濃度，并把孢子懸液原液稀釋至1×108個(gè)/mL，以此孢子懸液的濃度為初始濃度，依次稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，制得 1×104、1×105、1×106、1×107、1×108這5個(gè)濃度梯度的孢子懸液．

計(jì)算公式如下:孢子數(shù)/mL=A/5×25×10×1000×B=50000×A×B，式中:A:計(jì)數(shù)室四個(gè)角上的四個(gè)格和中間的一個(gè)格共計(jì)五個(gè)中格的微生物細(xì)胞數(shù)和;25:25個(gè)中格;B:樣液稀釋倍數(shù):10、1000:單位換算倍數(shù)［5］．

(2)玉米種植

種子篩選:將從種子市場采購的墾粘1號(hào)玉米種子經(jīng)過細(xì)心篩選，去除生蟲，干癟的不良個(gè)體，選出顏色，飽滿度，體積大小等生物量相近的健康玉米種子，共計(jì)選取180粒．分組:將這180粒墾粘1號(hào)玉米種子分為6個(gè)組，每組30粒，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10粒．播種和管理:準(zhǔn)備180個(gè)口徑20 cm，高15 cm的小塑盆，每盆裝3 kg供試土壤，然后將選好的種子放入土下約8 cm處，每盆種一粒種子，種子種完后，每盆澆100 mL水，之后按常規(guī)措施管理．

(3)玉米灌根

第一次灌根:玉米長到3葉-4葉幼苗期，測(cè)量每株玉米株高，之后進(jìn)行第一次灌根，每株100 mL，標(biāo)準(zhǔn)見表1．

表1 灌根標(biāo)準(zhǔn)

第二次灌根:第一次灌根15 d后，測(cè)量每株玉米株高之后進(jìn)行第二次灌根，灌根標(biāo)準(zhǔn)同表1．

(4)球孢白僵菌在玉米葉片中的定殖檢測(cè)

第二次灌根兩周后開始做球孢白僵菌在玉米葉片內(nèi)的定殖檢測(cè)．步驟如下:

取葉片:每個(gè)處理隨機(jī)選取10株玉米，取從心葉起向外數(shù)的第3片葉片，用剪刀剪取面積約25 cm2的葉片，每株取一片，按編號(hào)分開裝入寫好標(biāo)號(hào)的小塑料自封袋中．

洗葉片:先將取的玉米葉片在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用自來水沖洗干凈后再用滅菌水反復(fù)沖洗，徹底去除泥土之后，將葉片拿入在超凈工作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行再清洗，依次經(jīng)過3%次氯酸鈉消3 min，70%的酒精消毒3 min，最后用無菌水清洗3 min．

剪葉片:在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)過三次清洗后，將葉片用已滅菌鑷子夾到已滅菌的含有濾紙的培養(yǎng)皿中，用濾紙吸干葉片表面多余的水分，之后用鑷子把葉片夾在酒精燈火焰附近，用已滅菌的剪刀的首先剪去玉米葉片邊緣部分，然后將剩余的葉片剪成0．5 mm左右的小正方形．

接種:用已滅菌的鑷子將這些小正方形接種入已經(jīng)制備好的含有70 mg/L的多果定，125 mg/L頭孢霉素，138 mg/L硫酸卡納霉素的PPDA最適篩選培養(yǎng)基［6］上，每皿9片，之后用封口膜封口，拿出超凈工作臺(tái)，放入培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)，72 h后逐日觀察記錄球孢白僵菌在植物葉片內(nèi)的定殖情況．

球孢白僵菌在玉米葉片定殖率的計(jì)算公式如下:

定殖率=球孢白僵菌定殖的玉米株數(shù)∕試驗(yàn)總株數(shù)

(5)球孢白僵菌對(duì)玉米的促生作用

用玉米的生長速率來表明球孢白僵菌對(duì)玉米的促生作用，計(jì)算公式如下:

平均生長速率=第二次測(cè)的株高-第一次測(cè)的株高∕兩次測(cè)株高間隔的天數(shù)(cm/d)

(6)玉米抗蟲性的鑒定與調(diào)查

調(diào)查方法:在玉米生長的喇叭口期對(duì)種植的180株玉米逐株調(diào)查中上部葉片被玉米螟取食情況，按組分開做好數(shù)據(jù)記錄，根據(jù)玉米螟幼蟲取食心葉后所形成的葉片蟲孔直徑大小和數(shù)量劃分食葉級(jí)別，標(biāo)準(zhǔn)見表2．

表2 玉米螟取食調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

抗性評(píng)價(jià):將測(cè)得的數(shù)據(jù)與《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范》第5部分玉米抗玉米螟鑒定技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而評(píng)判玉米對(duì)玉米螟蟲害反應(yīng)程度和抵抗水平，標(biāo)準(zhǔn)見表3．

表3 蟲害級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)

玉米螟對(duì)每組玉米葉片食葉級(jí)別的平均值的計(jì)算方法如下:

平均食葉級(jí)別=∑(食葉級(jí)別×該級(jí)別株數(shù))∕調(diào)查總數(shù)

4 結(jié)果與分析

4．1 球孢白僵菌在玉米葉片的定殖檢測(cè)

經(jīng)由Excel軟件處理觀察記錄的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，用不同濃度菌懸液灌根的玉米，球孢白僵菌在玉米葉片的定殖率不同，孢子濃度在104到107之間時(shí)，孢子濃度越大定殖率越高，超過107這個(gè)濃度后，定殖率增加不明顯．1×104、1×105、1 ×106、1 ×107、1 ×108這5 個(gè)濃度的定殖率依次為 12%、13．5%、15．4%、16%、16．5%(如圖1所示)．

圖1 球孢白僵菌在玉米葉片中的定殖率

PPDA篩選培養(yǎng)基中球孢白僵菌在玉米葉片內(nèi)的的定殖結(jié)果如圖2所示:用孢子懸液灌根的玉米葉片在PPDA篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第三天，葉片周圍長出白色可見的球孢白僵菌，如圖2(a)所示;用孢子懸液灌根的玉米葉片在PPDA篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第八天，葉片周圍長出的球孢白僵菌菌落已基本形成，如圖2(b)所示．說明球孢白僵菌在玉米葉片中有定殖，并且球孢白僵菌在這個(gè)濃度的PPDA篩選培養(yǎng)基上生長良好．

4．2 球孢白僵菌對(duì)玉米的促生作用的測(cè)定

灌根前后檢測(cè)的每組玉米的株高，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，灌等量的水的第1組為對(duì)照組，生長速率為0．221 cm/d，不同濃度的菌液灌根后的玉米的生長速率不同，其中在第5組孢子濃度為107時(shí)對(duì)玉米生長速率有最大提高量為0．403 cm/d，如圖3所示，相對(duì)于對(duì)照組生長速率提高量為0．182 cm/d，之后增加孢子濃度，球孢白僵菌對(duì)玉米的促生效果增加不明顯．

圖2 葉片在PPDA篩選培養(yǎng)基中的定殖

圖3 球孢白僵菌菌灌根后玉米生長速率的變化

4．3 玉米抗蟲性的測(cè)定

每組每株玉米葉片的食葉級(jí)別檢測(cè)結(jié)果表明，球孢白僵菌菌懸液灌根的玉米心葉期食葉級(jí)別平均值集中在3．0～6．9之間，蟲害級(jí)別為3～5級(jí)，抗性為抗或中抗，如圖4所示．未用菌懸液灌根的玉米玉米心葉期食葉級(jí)別平均值為9．0，蟲害級(jí)別為9級(jí)，抗性為易感，因此，球孢白僵菌孢子懸液灌根玉米能很好的提高玉米的抗蟲性．

圖4 球孢白僵菌菌孢子懸液灌根玉米后玉米抗蟲性的變化

5 結(jié)論

不同孢子濃度的菌懸液對(duì)玉米灌根，孢子濃度在104到107間時(shí)，球孢白僵菌在玉米中的定殖率，對(duì)玉米的促生作用和抗蟲作用都增加明顯，超過107這個(gè)濃度后增加不明顯，最適濃度為107．因此，球孢白僵菌能在玉米中定殖，并對(duì)玉米有良好的促生和抗蟲作用的綠色生防菌，具有廣泛的應(yīng)用前景．

6 討論

球孢白僵菌等微生物制劑的廣泛應(yīng)用與發(fā)展，有效地降低了化學(xué)農(nóng)藥的使用量和使用頻率，充分發(fā)揮自然因子對(duì)田間害蟲的控制力度，這正是當(dāng)今全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向．就目前而言，應(yīng)從種植植物的當(dāng)?shù)丨h(huán)境因素入手，對(duì)球孢白僵菌在植物中的定殖和玉米螟對(duì)植物的為害規(guī)律進(jìn)行深入探討，形成以種植優(yōu)勢(shì)植物品種為主、微生物防治為輔的綜合防治體系，內(nèi)外兼顧，將應(yīng)用白僵菌防治玉米螟的生態(tài)優(yōu)勢(shì)更好地發(fā)揮出來．

［1］ 赫英偉．白僵菌的研究概況［J］．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(4):145-147．

［2］ 陸晴，佘花娣，佟文悅．應(yīng)用白僵菌防治玉米螟的研究進(jìn)展［J］．河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，17(5):59-62．

［3］ 齊永霞，陳方新．球孢白僵菌在玉米根際的定殖及對(duì)根際微生物的影響［J］．熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34(5):962-966．

［4］ 張愛文，劉維真，鄧春生，等．白僵菌制劑不同劑型防止玉米螟的研究［J］．生物防治通報(bào)，1990，6(3):118-120．

［5］ 顯微鏡直接計(jì)數(shù)技術(shù)．http://www．docin．com/p-702396241．html．

［6］ 王韜遠(yuǎn)，徐文靜，張正坤，等．球孢白僵菌分離培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(9):134-138．

［7］ 農(nóng)業(yè)部．玉米螟抗病蟲鑒定技術(shù)規(guī)范．NY/T 1248．5-2006．