球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的致病性和對(duì)天敵智利小植綏螨的間接影響

徐華蘋，賀小勇，蔣洪麗，張 慧，雷仲仁，解海翠，吳圣勇*

（1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島 0660042；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；4.南京市六合區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，南京 211500；5.北京依科世?？萍加邢薰?，北京 101102）

二斑葉螨TetranychusurticaeKoch為世界性害螨，寄主包括250多個(gè)科的1000多種植物，是多種經(jīng)濟(jì)作物和蔬菜上的重要害蟲，在我國(guó)每年發(fā)生10～20代[1,2]。由于長(zhǎng)期不合理的使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致二斑葉螨對(duì)很多殺蟲藥劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性，這給防治工作增添了難度[3]。生物防治是害蟲綠色防治的重要措施，如利用昆蟲病原真菌或捕食性天敵對(duì)二斑葉螨進(jìn)行防治可降低農(nóng)藥使用量，減少環(huán)境污染[4]。

球孢白僵菌是一種重要的廣譜性昆蟲病原真菌，可以侵染多種昆蟲和螨類，并且對(duì)害螨有一定的防治效果[5]。智利小植綏螨PhytoseiuluspersimilisAthias-Henriot是植綏螨科最早開發(fā)的天敵產(chǎn)品，同時(shí)是葉螨的最主要專食性天敵[5]。利用球孢白僵菌或智利小植綏螨防治二斑葉螨已有較多報(bào)道[6-10]。由于二斑葉螨繁殖速度快，在單獨(dú)應(yīng)用球孢白僵菌防治二斑葉螨時(shí)，噴菌數(shù)天后，二斑葉螨種群數(shù)量會(huì)很快回升；而單獨(dú)應(yīng)用捕食螨防治二斑葉螨時(shí)，由于捕食螨的體型較小，捕食能力有限，以致防治高密度葉螨種群的效果并不理想[11,12]。多天敵聯(lián)合應(yīng)用是近年來(lái)害蟲生物防治發(fā)展的重要方向，為提高害蟲生物防治效果提供了新的思路[13]。關(guān)于昆蟲病原真菌與捕食螨聯(lián)合應(yīng)用防控害蟲已有廣泛報(bào)道[6,14,15]，但二者聯(lián)合應(yīng)用可能存在協(xié)同增效或拮抗抑制作用，從而直接影響對(duì)害蟲的防治效果[13]。已有研究結(jié)果顯示，球孢白僵菌和智利小植綏螨聯(lián)合應(yīng)用可以有效降低二斑葉螨對(duì)葉片的為害率[16]，提高對(duì)溫室玫瑰上二斑葉螨的防治效果[15]。由于球孢白僵菌具有殺蟲廣譜性，其在侵染害蟲的同時(shí)，可能對(duì)天敵捕食螨也有潛在的侵染風(fēng)險(xiǎn)，已發(fā)現(xiàn)某些球孢白僵菌菌株（GHA）直接噴施于智利小植綏螨體上，對(duì)智利小植綏螨具有致死作用[16]。Vergel等[15]發(fā)現(xiàn)通過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)智利小植綏螨噴施球孢白僵菌油劑濃度為 1.25×107個(gè)孢子/mL的懸浮液，死亡率為43%。此外，當(dāng)害蟲（害螨）、球孢白僵菌和捕食螨三者共存時(shí)，捕食螨傾向于捕食被菌侵染的行動(dòng)緩慢的害蟲[17]，從而可能對(duì)捕食螨產(chǎn)生間接影響[18]。目前關(guān)于球孢白僵菌與捕食螨聯(lián)合防治二斑葉螨時(shí)對(duì)捕食螨的間接影響還沒(méi)有報(bào)道。

本研究評(píng)價(jià)球孢白僵菌（菌株 GZGY-1-3）對(duì)二斑葉螨的致病力，以及球孢白僵菌通過(guò)侵染二斑葉螨對(duì)智利小植綏螨致死率，生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響。研究結(jié)果將有助于深入理解球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的間接影響，并為二者聯(lián)合防治二斑葉螨的可行性提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試螨類

二斑葉螨和智利小植綏螨種群由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。二斑葉螨在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)由盆栽的蕓豆苗上飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)溫度為（25±2）℃，濕度（70±5）%，光周期16L∶8D。

智利小植綏螨的飼養(yǎng)方式：將海綿放入帶水的塑料盒（長(zhǎng)25 cm、寬15 cm、高9 cm）中，讓其充分吸收水分，海綿略高于水面，距塑料盒四周 1～2 cm。在海綿上面平鋪同等大小的黑色塑料膜，在塑料薄膜上面放入帶有二斑葉螨的蕓豆葉片，葉柄上纏有脫脂棉條，脫脂棉條的另一端放入水中保濕。將智利小植綏螨放入帶有二斑葉螨的蕓豆葉片上飼養(yǎng)。飼養(yǎng)濕度為 70%±5%，溫度（25±2）℃，光周期 16L∶8D。

1.2 球孢白僵菌菌株及供試培養(yǎng)基

本研究所用的球孢白僵菌菌株GZGY-1-3是在貴陽(yáng)市的亞洲玉米螟OstriniafurnacalisGuenée蟲體上采集并分離得到，并用薩氏培養(yǎng)基（SDAY）培養(yǎng)和純化。之前研究證明該菌株對(duì)智利小植綏螨沒(méi)有直接的致病風(fēng)險(xiǎn)[19]。

1.3 球孢白僵菌孢子懸浮液的制備

球孢白僵菌菌株在（26±1）℃條件下，于SDAY上培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌接菌環(huán)將分生孢子從SDAY平板上刮下，放入已滅菌的0.05%吐溫-80溶液中，配制成球孢白僵菌孢子懸浮液。之后用血球計(jì)數(shù)板（25×16型）計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)3次，取平均數(shù)，獲得球孢白僵菌孢子懸浮液。根據(jù)現(xiàn)有濃度，用0.05%的吐溫-80溶液將其稀釋成濃度為1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL的懸浮液，同時(shí)觀察球孢白僵菌的孢子萌發(fā)率，萌發(fā)率大于90%方可用于試驗(yàn)。

1.4 球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨生物活性測(cè)定

將與培養(yǎng)皿底部大小相同的濾紙平鋪在培養(yǎng)皿（直徑為6 cm）底部，并用純凈水將濾紙噴濕。用與培養(yǎng)皿同等大小的蕓豆葉片放到培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上（葉背向上），之后用濕脫脂棉條將四周壓住，每天更換新鮮葉片用于飼養(yǎng)二斑葉螨。為獲得齡期一致的二斑葉螨，從供試種群中挑取若螨進(jìn)行培養(yǎng)，待最后獲得剛發(fā)育至成螨的葉螨進(jìn)行試驗(yàn)。用手持小噴壺（2 mL）將上述不同濃度的孢子懸浮液分別噴灑到二斑葉螨體上，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20頭成螨（共80頭）。對(duì)照組用含0.05%吐溫-80溶液噴灑。噴菌后，將培養(yǎng)皿放到濕度為70%±5%，溫度（25±2）℃，光周期16L∶8D的培養(yǎng)箱中。每日觀察并記錄二斑葉螨的死亡蟲數(shù)，并挑出死螨。將死螨挑出放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行保濕培養(yǎng)，觀察蟲體上是否有球孢白僵菌長(zhǎng)出，并作為判斷是否由球孢白僵菌侵染致死的依據(jù)。試驗(yàn)連續(xù)觀察7 d。利用所獲數(shù)據(jù)計(jì)算二斑葉螨的校正死亡率、致死中濃度LC50和致死中時(shí)LT50。校正死亡率（%）＝（處理死亡率—對(duì)照死亡率）/（1—對(duì)照死亡率）×100%。

1.5 球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的間接影響

從智利小植綏螨種群中收集剛發(fā)育至雌成螨的個(gè)體，置于兩片透明的壓克力板構(gòu)成的小室（長(zhǎng)50 mm、寬50 mm、厚度3 mm）中[20]。成蟲產(chǎn)卵后，用極細(xì)毛筆挑到新的小室中，直至卵孵化。利用上面獲得的致死中濃度劑量的球孢白僵菌懸浮液噴施二斑葉螨。將噴施球孢白僵菌后放置16、24、36和48 h的二斑葉螨（足夠多的二斑葉螨成螨，以滿足智利小植綏螨產(chǎn)卵期的取食）分別放入不同小室內(nèi)供智利小植綏螨取食，每個(gè)小室內(nèi)放1頭上述初孵化的智利小植綏螨。對(duì)照組處理，用0.05%吐溫-80噴施二斑葉螨。小室放入溫度為（25±2）℃，濕度為70%±5%和光照周期為16L∶8D的人工氣候箱內(nèi)。每天觀察并記錄各處理智利小植綏螨的死亡蟲數(shù)。共觀察10 d，取第10 d的死亡結(jié)果。

同上述方法，連續(xù)飼養(yǎng)兩代智利小植綏螨，每天觀察以噴菌后放置不同時(shí)間（16、24、36和48 h）的二斑葉螨為獵物的智利小植綏螨的蛻皮情況和產(chǎn)卵量，從而計(jì)算智利小植綏螨發(fā)育歷期和單雌產(chǎn)卵量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)回歸分析中的Probit比較，求出球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的致死中時(shí)LT50。校正死亡率換算成機(jī)率值與不同濃度的對(duì)數(shù)進(jìn)行回歸分析，求出致死中濃度LC50。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的致病力

二斑葉螨的校正死亡率隨施用球孢白僵菌孢子濃度的增加而升高。與其他處理濃度相比，在 1×108孢子/mL濃度下，二斑葉螨的校正死亡率最高（F＝24.59，p＜0.01）（圖1）。二斑葉螨的LT50隨施用球孢白僵菌濃度的增加而降低。在1×106～1×108孢子/mL濃度下，球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的LT50顯著低于對(duì)照處理（F＝55.03，p＜0.01）（圖 2）。經(jīng)計(jì)算得球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的 LC50為 1.37×106孢子/mL。

圖1 不同濃度的球孢白僵菌侵染二斑葉螨7 d后的致死率Fig.1 Corrected mean mortality of B.bassiana with different concentrations in T.urticae at 7 days post-treatment

圖2 不同濃度的球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的致死中時(shí)Fig.2 The lethal time of B.bassiana with different concentrations to T.urticae

2.2 球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的間接影響

球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的間接致死率的研究結(jié)果顯示：用噴施球孢白僵菌1、24、36和48 h后的二斑葉螨分別飼喂智利小植綏螨，發(fā)現(xiàn)智利小植綏螨第10 d的校正死亡率在各處理間沒(méi)有顯著差異（F＝0.3，p＝0.87），且均低于0.67%（圖3）。

圖3 球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的致死率Fig.3 The lethal rate of B.bassiana on the P.persimilis

球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨 F0代生長(zhǎng)發(fā)育間接影響的研究結(jié)果顯示：用噴施球孢白僵菌16、24、36和48 h后的二斑葉螨分別飼喂智利小植綏螨，智利小植綏螨第二若螨、產(chǎn)卵前期、世代歷期以及產(chǎn)卵量發(fā)生變化（表 1），其幼螨歷期和第一若螨歷期在各處理間差異均不顯著（幼螨：F＝0.72，p＝0.58；第一若螨：F＝1.02，p＝0.41）。與對(duì)照相比，在36和48 h處理中，智利小植綏螨第二若螨歷期分別延長(zhǎng) 40.9%和35.87%（F＝3.20，p＜0.05）。與對(duì)照相比，在24、36和48 h處理中，智利小植綏螨的產(chǎn)卵前期分別延長(zhǎng)33.0%、28.70%和39.0%（F＝2.84，p＜0.05）。與對(duì)照相比，在48 h處理中智利小植綏螨整個(gè)世代歷期延長(zhǎng) 19.6%（F＝3.06，p＜0.05）。

表1 F0代智利小植綏螨取食球孢白僵菌處理不同時(shí)間的二斑葉螨的發(fā)育歷期Table 1 The developmental period of T.urticae in different time after feeding on P.persimilis (F0) infected by B.bassiana

智利小植綏螨取食被球孢白僵菌侵染的二斑葉螨后，在36、48 h處理中，成螨的單雌產(chǎn)卵量顯著低于對(duì)照處理（F＝310.8，p＜0.01）。

球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨F1代生長(zhǎng)發(fā)育間接影響的研究結(jié)果顯示：用噴施球孢白僵菌16、24、36和48 h后的二斑葉螨飼喂智利小植綏螨至F1代。與對(duì)照相比，各處理中智利小植綏螨的卵歷期、幼螨歷期、第一若螨歷期、第二若螨歷期、產(chǎn)卵前期和世代歷期差異均不顯著（表2，卵歷期：F＝1.02，p＝0.99；幼螨歷期：F＝0.07，p＝0.99；第一若螨歷期：F＝0.08，p＝0.99；第二若螨歷期：F＝0.10，p＝0.98；產(chǎn)卵前歷期：F＝0.36，p＝0.84；世代歷期：F＝0.531，p＝0.71）。

表2 F1代智利小植綏螨取食球孢白僵菌處理后不同時(shí)間的二斑葉螨的發(fā)育歷期Table 2 The developmental period of T.urticae in different time after feeding on P.persimilis (F1) infected by B.bassiana

對(duì)智利小植綏螨F1代的單雌產(chǎn)卵量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：不同處理間智利小植綏螨的產(chǎn)卵量無(wú)顯著差異（F＝0.11，p＝0.98）。

3 討論

利用球孢白僵菌防控害蟲是目前害蟲生物防治的重要手段之一[21]。已有研究結(jié)果顯示，多種球孢白僵菌菌株對(duì)二斑葉螨具有較高的致病力，但不同菌株對(duì)二斑葉螨的致病力不同[19,22,23]。前期研究結(jié)果表明，與其他球孢白僵菌菌株相比較，在1×107孢子/mL濃度下，本試驗(yàn)所用菌株對(duì)二斑葉螨的校正死亡率較高[19]。本研究在原來(lái)工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了該菌株不同濃度下對(duì)二斑葉螨的致病力。結(jié)果表明，二斑葉螨的致死率隨著孢子濃度的增加而增加，1×108孢子/mL濃度下，球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的致病力最強(qiáng)；此濃度下，球孢白僵菌對(duì)二斑葉螨的 LT50為 5.0 d。研究結(jié)果與 Wekesa等[24]報(bào)道的球孢白僵菌對(duì)伊氏葉螨的LT50（4.6～5.8 d）接近。本研究同時(shí)還獲得該菌株對(duì)二斑葉螨的LC50為1.37×106孢子/mL。

利用上述球孢白僵菌LC50噴施二斑葉螨，繼而飼喂智利小植綏螨。結(jié)果顯示，智利小植綏螨取食被球孢白僵菌侵染48 h內(nèi)的二斑葉螨的死亡率均低于2%。因此，球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的間接影響作用較小。觀察連續(xù)兩個(gè)世代的智利小植綏螨取食被球孢白僵菌侵染的二斑葉螨后的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖力變化，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨不同世代的間接影響不同。在F0代中，隨噴菌時(shí)間的延長(zhǎng)，智利小植綏螨的第二若螨歷期、產(chǎn)卵前期、整個(gè)世代歷期延長(zhǎng)，但單雌產(chǎn)卵量降低。在F1代中，智利小植綏螨不同螨態(tài)的發(fā)育歷期和單雌產(chǎn)卵量在各處理間均無(wú)顯著差異。Seiedy等[25]發(fā)現(xiàn)，智利小植綏螨取食被球孢白僵菌（菌株為DEBI008）侵染的二斑葉螨后，成蟲壽命縮短，繁殖力降低，但并未對(duì)捕食螨后代進(jìn)行觀察。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨的 F0代有一定的亞致死影響，但對(duì) F1代無(wú)影響，表明球孢白僵菌對(duì)智利小植綏螨間接影響不在世代間傳遞。宋麗雯[26]認(rèn)為連續(xù)世代飼養(yǎng)可能引起捕食螨對(duì)球孢白僵菌的抗性增強(qiáng)。Wu等[18]發(fā)現(xiàn)，捕食螨取食球孢白僵菌孢子后，孢子并不能穿過(guò)捕食螨的腸道，同時(shí)孢子的細(xì)胞壁出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。本試驗(yàn)中球孢白僵菌對(duì)F0代捕食螨的亞致死作用可能通過(guò)球孢白僵菌侵染二斑葉螨后所產(chǎn)生的白僵菌素等毒素所致[27]。

總之，本研究所用球孢白僵菌菌株對(duì)二斑葉螨致病性較高，可用于對(duì)二斑葉螨的防治。本試驗(yàn)前期研究表明，球孢白僵菌在處理葉螨后的12 h，孢子附著在葉螨體壁，并在24～36 h萌發(fā)，48 h后可以穿透螨的體壁。因此，在噴菌后的短期內(nèi)（48 h），大部分葉螨仍然成活，但行動(dòng)緩慢。本研究證明了智利小植綏螨取食被菌處理48 h內(nèi)的葉螨后其亞致死影響相對(duì)較低，即對(duì)智利小植綏螨的風(fēng)險(xiǎn)是在可接受范圍內(nèi)。因此，實(shí)際生產(chǎn)中，在安全期內(nèi)，球孢白僵菌與智利小植綏螨聯(lián)合應(yīng)用防治二斑葉螨是可行的。