單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植對再生障礙性貧血的臨床觀察及其促進造血機制的初步療效研究

徐麗昕 閆 蓓 張旭輝 吳亞妹 李曉紅 曹永彬 吳曉雄

單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植對再生障礙性貧血的臨床觀察及其促進造血機制的初步療效研究

徐麗昕 閆 蓓 張旭輝 吳亞妹 李曉紅 曹永彬 吳曉雄

目的探討單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療再生障礙性貧血的初步療效。方法選取2012年12月至2014年12月間我院收治的5例再生障礙性貧血患者為研究對象，給予患者單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療。術(shù)后觀察患者回輸?shù)腗NC、CD34+細胞數(shù)，GVHD發(fā)生率，血象恢復時間，SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO、IL-11、SCF等細胞因子變化情況，以及骨髓有核細胞磷酸化ERK1/2蛋白改善情況，并統(tǒng)計并發(fā)癥發(fā)生情況。結(jié)果5例患者均獲得造血重建，移植后血小板恢復時間平均為15 d，血細胞恢復時間平均為10.4 d。3例患者發(fā)生Ⅲ度aGVHD，3例患者發(fā)生局限性cGVHD，經(jīng)治療后均好轉(zhuǎn)，4例患者恢復良好，1例患者術(shù)后73 d死于真菌性肺炎。移植后患者血清SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO以及SCF水平明顯改善（P＜0.05）；治療后骨髓有核細胞磷酸化ERK1/2蛋白明顯高于治療前（P＜0.05）；1例患者EB病毒血癥，2例出血性膀胱炎，2例真菌性肺炎。結(jié)論單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療再生障礙性貧血療效顯著，能夠明顯改善患者骨髓造血微環(huán)境，安全且并發(fā)癥低，值得進一步開展臨床應用研究。

單倍體造血干細胞臍帶間充質(zhì)干細胞移植再生障礙性貧血

再生障礙性貧血（SAA）是一組由多種病因所致的骨髓功能障礙，主要表現(xiàn)為全血細胞減少[1]，發(fā)病機制尚不明了，可能與化學藥物、放射線、病毒感染及遺傳因素有關。多見于青壯年。治療方法包括病因治療、支持療法和促進骨髓造血功能恢復的各種措施[2]。單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療再生障礙性貧血屬于先進技術(shù)，僅有少數(shù)幾個治療中心進行嘗試[3]。為了探討本治療方法的初步療效及安全性，我院在2012年12月至2014年12月，對5例再生障礙性貧血患者進行治療。治療前，患者及家屬均知情同意，治療方案獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2012年12月至2014年12月間我院收治的5例再生障礙性貧血患者為研究對象，其中男性2例，女性3例；年齡4～39歲，平均年齡13.4歲；病程4～48個月，平均14個月；4例患者為重型再生障礙性貧血，1例患者為先天性純紅再生障礙性貧血。供者年齡12～41歲，平均年齡30.6歲；4例為親緣供者，1例為非親緣供者；所有供者體格檢查證實均符合造血干細胞移植供者捐獻的標準，自愿提供干細胞，并簽署造血干細胞捐獻知情同意書。臍帶間充質(zhì)干細胞來源于北京市臍血庫。

1.2 治療方法

重組人粒細胞集落刺激因子皮下注射5～6 d，第5天采集骨髓200～800 mL，MNC（2～3）×108cells/Kg，第6～7天以CS3000plus（Baxter公司）分離外周血干細胞，每次循環(huán)血量8～10 L，終體積為0.2 L，輸入MNC 5×108cells/Kg，CD34+細胞數(shù)（2.0～4.0）×106 cells/Kg。

患者移植預處理選用福達拉濱+兔抗人胸腺細胞球蛋白+環(huán)磷酰胺為基礎的方案，4例患者為CTX (700/m2)+Flud+ATG，1例患者因骨髓存在灶性增生活躍，在該方案基礎上加用減量BU（1.1mg/Kg·6h）2 d。0 d回輸供者骨髓，回輸前6 h輸注臍帶MSC 2 U。+1 d、+2 d輸供者造血干細胞，輸注前給予碳酸氫鈉堿化、地塞米松、異丙嗪等藥物。輸供者造血干細胞同時，給予抗炎、保肝等治療，并預防并發(fā)癥。

采用聯(lián)合免疫抑制方案，即環(huán)孢素+霉酚酸酯+巴利昔單克隆抗體（CD25單克隆抗體）預防急性移植物抗宿主病。

1.3 觀察指標

從移植前開始至移植后+5 d、+10 d、+15 d、+20 d留取患者外周血標本，用ELISA方法檢測SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO和SCF值的變化。Western boltting法分析治療前后骨髓有核細胞ERK蛋白表達及磷酸化水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 治療效果

5例患者回輸?shù)腗NC平均為11.27×108cells/Kg，CD34+細胞數(shù)4.0×106cells/Kg。5例患者均獲得造血重建，移植后1個月復查，4例患者嵌合體均為100%供者嵌合，1例患者為90%供者嵌合，5例患者移植后血小板恢復時間平均為15 d，血細胞恢復時間平均為10.4 d。3例患者發(fā)生Ⅲ度aGVHD，3例患者發(fā)生局限性cGVHD，經(jīng)治療后均好轉(zhuǎn)。4例患者恢復良好，1例患者73 d死于真菌性肺炎。

2.2 相關細胞因子變化情況

移植5 d后患者血清SDF-1α、TPO和SCF水平顯著高于移植前，移植20 d后患者血清G-CSF、IL-6以及GM-CSF水平顯著低于移植前（P＜0.05）（表1）。

2.3 治療前后骨髓有核細胞磷酸化ERK1/2蛋白的表達情況比較

治療后骨髓有核細胞磷酸化ERK1/2蛋白（0.63±0.08）明顯高于治療前（0.42±0.06）（P＜0.05）。

2.4 并發(fā)癥發(fā)生情況

5例患者移植期間均出現(xiàn)不同程度的惡心、嘔吐等不良反應，給予對癥、支持治療后好轉(zhuǎn)。1例患者EB病毒血癥，2例出血性膀胱炎，2例真菌性肺炎。

表1 患者移植前后相關生長因子變化情況Table1 The changes of related growth factors before and after transplantation

3 討論

再生障礙性貧血是血液科危重癥之一，起病急，進展快，死亡率高。Allo-HSCT是治療再生障礙性貧血的首先方法，但約僅有30%的患者能找到HLA相同的供者，而單倍型相合的親緣供者較易找到[4]。

本研究采用單倍體造血干細胞，聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植，治療再生障礙性貧血，初步結(jié)果顯示，5例患者均獲造血重建，血象恢復較快，并發(fā)癥較低，療效滿意。血清相關細胞因子水平得到顯著改善。本方法采用單倍體造血干細胞，能夠迅速恢復造血，其中的大量基質(zhì)細胞還能夠調(diào)節(jié)免疫功能，降低GVHD的發(fā)生率。臍帶間充質(zhì)干細胞是來源于發(fā)育早期中胚層的一類多能干細胞，存在于多種組織內(nèi)，有多種細胞因子能夠促進干細胞植入免疫調(diào)控和自我復制，且免疫源性非常低[5]。單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植，還可顯著加快移植后的造血重建。此外，再生障礙性貧血是骨髓衰竭性疾病的一種，骨髓衰竭性疾病還包括AA-PNH、MDS，臨床一般性治療效果差[6]。以后有望將本方法延展至所有骨髓衰竭性疾病的治療，提高該類疾病的療效。本研究還為進一步開展聯(lián)合UC-MSCs的Haplo-SCT治療其他惡性血液病提供了臨床和實驗依據(jù)。

研究證實，骨髓造血微環(huán)境的損傷及造血細胞因子分泌紊亂，是導致再生障礙性貧血發(fā)生的重要原因；細胞免疫，尤其是T淋巴細胞質(zhì)和量的變化也起了重要的作用[7]。人體SDF-1/CXCR-4介導的相關歸巢效應能加速造血重建。此外，SDF-1/CXCR-4通過產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)分子，介導與骨髓基質(zhì)的黏附，使歸巢的HSC穩(wěn)定黏附于骨髓微環(huán)境，進而改善造血微環(huán)境。白細胞介素-6是骨髓基質(zhì)細胞所分泌的多種細胞因子中的一種，在免疫應答、急性期反應、造血調(diào)節(jié)等過程中都發(fā)揮重要作用[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，UC-MSCs的聯(lián)合移植可改善骨髓造血微環(huán)境，促進造血干細胞的植入[9-10]。本研究也發(fā)現(xiàn)移植后患者的造血相關細胞因子血清水平得到明顯改善，治療后骨髓有核細胞磷酸化ERK1/2蛋白明顯高于治療前，ERK1/2蛋白參與造血干/祖細胞增殖與分化，磷酸化ERK1/2蛋白為其功能的活性狀態(tài)，磷酸化程度增加則促進造血干/祖細胞增殖，磷酸化ERK1/2蛋白水平的增加，提示造血干/祖細胞增殖與分化能力增加，造血微環(huán)境改善。但受限于時間及病例數(shù)，其促進造血的機制尚有待于深入研究。

綜上所述，單倍體造血干細胞聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植，治療再生障礙性貧血療效顯著，能夠明顯改善患者骨髓造血微環(huán)境，安全且并發(fā)癥低，值得臨床進一步開展應用研究。

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[5]徐麗昕，曹永彬，王志紅，等.單倍體相合造血干細胞聯(lián)合臍帶血間充質(zhì)干細胞移植治療急性重型再生障礙性貧血的療效觀察[J].中國實驗血液學雜志,2011,19(5):1241-1245.

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Clinical Effect of Transplantation of Haploid Hematopoietic Stem Cells Combined with Cord Mesenchymal Stem Cells in Treating Aplastic Anemia

XU Lixin1,YAN Bei1,ZHANG Xuhui2,WU Yamei1,LI Xiaohong1,CAO Yongbin1,WU Xiaoxiong1.1 Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048,China; 2 Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China.Corresponding author:WU Xiaoxiong(E-mail: xiongwuxiao@sohu.com).

ObjectiveTo investigate the clinical effect of transplantation of haploid hematopoietic stem cells combined with cord mesenchymal stem cells in the treatment of aplastic anemia.MethodsFrom December 2012 to December 2014, 5 cases with aplastic anemia were treated with haploid hematopoietic stem cells combined with cord mesenchymal stem cells transplantation.The MNC,CD34+cells,GVHD incidence,blood recovery time,changes of related growth factors(like SDF-1α,G-CSF,IL-6,GM-CSF,TPO,SCF),the improvement of bone marrow nucleated cells protein phosphorylation ERK1/2 and complications were all observed.ResultsFive patients obtained hematopoietic reconstitution with MNC of 11.27×108cells/Kg and CD34+of 4.0×106cells/Kg.The average platelet recovery time was 15 days and the average recovery time of blood cells was 10.4 days.aGVHD of stage III was observed in 3 patients,localized cGVHD was observed in 3 patients,and they were all improved after treatment.Four patients recovered well,one patient died of fungal pneumonia 73 days after treatment.After transplantation,serum SDF-1α,G-CSF,IL-6,GM-CSF,TPO and SCF were significantly improved(P＜0.05), the expression of phosphorylation ERK1/2 protein of bone marrow nucleated cells was significantly increased(P＜0.05).Onecase of EB viremia,two cases of hemorrhagic cystitis and two cases of fungal pneumonia were observed.Conclusion Haploid hematopoietic stem cells combined with cord mesenchymal stem cell transplantation is effective in the treatment of aplastic anemia,it can significantly improve the bone marrow microenvironment of patients with higher safety and lower complication.It is worthy of further clinical application.

Haploid hematopoietic stem cells;Umbilical cord mesenchymal stem cells;Transplantation;Aplastic anemia

R556+.5

A

1673-0364（2015）05-0292-03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.002

2015年7月20日；

2015年9月9日）

總醫(yī)院科研扶持基金（2012FC-TSYS-4007）。

100039北京市解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科（徐麗昕，閆蓓，吳亞妹，李曉紅，曹永彬，吳曉雄）；100850北京市軍事醫(yī)學科學院二所（張旭輝）。

吳曉雄（E-mail：xiongwuxiao@sohu.com）。