分散固相萃取-高效液相色譜法測定小麥中啶氧菌酯

謝飛飛,黃曉東,盧 健,張 飛

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

分散固相萃取-高效液相色譜法測定小麥中啶氧菌酯

謝飛飛,黃曉東?,盧 健,張 飛

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

建立分散固相萃取-高效液相色譜法測定小麥中啶氧菌酯殘留的方法.應(yīng)用分散固相萃取處理小麥樣品,離心得到的上清液過濾膜后,用HPLC-DAD進行檢測.采用島津wondasil C18-WR(5μm,250 mm× 4.6 mm)色譜柱,柱溫30℃,乙腈-水(65∶35,V/V)為流動相,流速1.0 m L/min.啶氧菌酯在0.05～1.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R＝0.999 9),變異系數(shù)為3.34%,平均回收率為89.32%.實驗方法操作快速簡便、重復(fù)性好,適用于小麥中啶氧菌酯的定量檢測與分析.

高效液相色譜;分散固相萃取;啶氧菌酯;小麥

啶氧菌酯(picoxystrobin)是一種新型甲氧基丙烯酸酯類抗菌劑,具有殺菌活性強且持久性好的特點,對小麥的葉枯病、網(wǎng)斑病和云紋病具有很強的治愈性[1-4].然而,這類低毒殺菌劑在使用若干年后產(chǎn)生抗藥性,成為影響人們身體健康的安全隱患.目前,加拿大、歐盟、新西蘭等國均規(guī)定了啶氧菌酯在小麥中的最大殘留限量,分別為0.06 ppm、0.05 ppm、0.01 ppm,而我國卻未做規(guī)定.由此看來,未來啶氧菌酯可能成為國外限制我國小麥出口的新一輪技術(shù)壁壘,故研究啶氧菌酯殘留的檢測方法具有現(xiàn)實意義.

目前報道的啶氧菌酯的檢測方法主要有氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6-8]、氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法[9-10]、流體化學(xué)發(fā)光注射法[11],這些方法主要針對水果、水樣和白酒中殘留的啶氧菌酯的分析[12],對小麥中啶氧菌酯的檢測未見報道.以上方法可靠,但步驟繁瑣.使用分散固相萃取-高效液相色譜法對小麥中啶氧菌酯的含量進行定量分析,簡化了樣品的處理步驟,節(jié)約了有機試劑用量,同時也減少了對操作人員的傷害,從而為控制小麥中啶氧菌酯殘留水平、實現(xiàn)小麥安全生產(chǎn)、保護消費者健康以及制定小麥中啶氧菌酯最大殘留限量提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥,產(chǎn)自安徽蕪湖;啶氧菌酯標(biāo)樣(純度≥99%,德國Dr.Ehrenstorfer);N-丙基-乙二胺(PSA)、C18、C8(濟南博納生物技術(shù)有限公司);檸檬酸二鈉1.5水合物(分析純,Aladdin-阿拉丁試劑上海有限公司);乙腈(色譜純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);氯化鈉、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、乙酸、檸檬酸鈉(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);水為二次蒸餾水.

1.2 儀器和設(shè)備

Prominence LC-20A高效液相色譜儀(配有DAD二極管陣列檢測器)(日本島津公司);TD5Z臺式低速離心機(湖南凱達科學(xué)儀器有限公司);TDZ4-WS低速臺式離心機(湖南湘儀集團);FW100高速萬能粉粹機(天津市泰斯特儀器有限公司);美國Labnet VX-200旋渦混合儀.

1.3 實驗方法

(1)液相色譜條件.島津wondasil C18-WR色譜柱(5μm,250 mm×4.6 mm);柱溫:30℃;檢測器:二極管陣列檢測器(DAD);流速:1.0 m L/min;進樣量:10μL;流動相:乙腈:水＝65∶35;檢測波長:245 nm.

(2)標(biāo)準曲線的繪制.外標(biāo)法定量,準確稱取5.0 mg啶氧菌酯標(biāo)樣,用乙腈配制成1.0 mg/m L的啶氧菌酯標(biāo)準儲備液(不用時置于－18℃以下冰箱避光儲存),再用乙腈配制成0.01 mg/m L的啶氧菌酯中間儲備液(不用時置于0～4℃冰箱避光儲存).用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0μg/m L、0.5μg/m L、0.2μg/m L、0.1μg/m L、0.05μg/m L的啶氧菌酯標(biāo)準溶液,在選定色譜條件下進行HPLC-DAD檢測,并計算啶氧菌酯標(biāo)準曲線線性關(guān)系方程.

(3)樣品處理.將小麥粉碎后,充分混勻.稱取4.0 g小麥樣品于50 m L離心管中,加入10 m L水,充分混勻后加入5 m L 1%乙酸酸化的乙腈溶液,0.5 g NaOAc,2.0 g MgSO4,蝸旋振蕩5 min使充分混合,轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心5 min,取上層清液2 m L于10 m L的離心管中,加入100 mg PSA,300 mg無水硫酸鎂,蝸旋振蕩5 min,轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min,靜置,取上層清液,過0.45μm濾膜,供HPLC-DAD分析.

(4)分散固相萃取條件的選擇.

①分散吸附劑種類的選擇.在小麥粉樣品中添加了質(zhì)量濃度為1.0 mg/kg的啶氧菌酯標(biāo)準液后,分別用PSA、C18、C8、PSA和C18、PSA和C8、C18和C8這6種組合方式作為分散吸附劑,在其他條件完全相同的情況下,按照上述1.3(3)進行樣品處理,供HPLC分析,計算回收率,確定分散吸附劑的種類.

②分散吸附劑加入量的選擇.在確定了最佳分散基質(zhì)萃取劑種類后,考察不同用量對回收率的影響.在加標(biāo)水平為1.0 mg/kg的小麥粉樣品中,分別加入60 mg、80 mg、100 mg、120 mg的分散吸附劑,按上述1.3(3)步驟處理樣品,分析計算啶氧菌酯的回收率,確定最佳用量.

③樣品加入量的選擇.準確稱取小麥粉樣品3.0 g、3.5 g、4.0 g、4.5 g、5.0 g,啶氧菌酯標(biāo)準液添加質(zhì)量濃度為1.0 mg/kg,按上述1.3(3)進行樣品處理,HPLC分析后,以回收率的高低作為選定最佳樣品加入量的標(biāo)準.

④加水量的選擇.把水加入到勻質(zhì)后的小麥粉樣品中,以加大樣品分散程度.在加標(biāo)水平為1.0 mg/kg的小麥粉樣品中,分別加入6 m L、8 m L、10 m L、12 m L、14 m L的水,按上述1.3(3)進行樣品處理,通過HPLC分析計算其回收率,確定最優(yōu)加水量.

⑤方法的重復(fù)性實驗.在選定的最佳實驗條件下對加標(biāo)水平為1.0 mg/kg的小麥粉樣品進行處理及測定,連續(xù)5天每天測1次,計算其精密度.

⑥方法的回收率實驗.在小麥樣品中添加啶氧菌酯標(biāo)準液,添加水平分別為0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg,在選定的最佳實驗條件下分析,平行測定5次,計算相應(yīng)的添加回收率和變異系數(shù).

⑦結(jié)果計算公式.啶氧菌酯質(zhì)量含量c1(μg/g)按下式計算:

式中,c1為樣品中啶氧菌酯含量,μg/g;c為儀器檢測的質(zhì)量濃度,mg/L;V為最終定容體積,m L;m為樣品質(zhì)量,g.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

(1)分散吸附劑種類的選擇.用液相色譜法定量分析食品中的農(nóng)藥殘留時,由于基質(zhì)復(fù)雜,如果樣品提取后不經(jīng)凈化處理,共流出物會影響目標(biāo)離子,從而降低檢測器的靈敏度.為了消除干擾,對比研究了不同種類的分散吸附劑及其不同組合方式的凈化效果,結(jié)果如圖1所示.由圖1可知,兩種分散劑同時添加時對小麥粉中啶氧菌酯的回收率沒有起到改善的效果,可能是因為兩種分散吸附劑同時吸附雜質(zhì)時,造成了啶氧菌酯的損失.而使用一種分散劑時啶氧菌酯的回收率相對較高,其中,采用PSA做分散吸附劑時啶氧菌酯的回收率最高,故選擇PSA為分散吸附劑.

(2)分散吸附劑用量的優(yōu)化.對比了不同用量分散劑對凈化效果的影響,結(jié)果如圖2所示.由圖2可知,在萃取凈化過程中PSA的用量對小麥粉中啶氧菌酯的回收率有明顯影響,加入120 mg PSA作用時,樣品色譜圖中出現(xiàn)的雜峰較多,并且部分干擾與樣品峰重疊,峰形差,回收率偏低,推測可能是由于PSA在去除基質(zhì)干擾的同時對目標(biāo)物也有一定的吸附.其余的回收率R的高低順序表現(xiàn)為:R100 mg PSA＞ R80 mg PSA＞R60 mg PSA,最后選定100 mg PSA作為最優(yōu)添加量,基質(zhì)干擾較小,回收率較高.

(3)樣品加入量的優(yōu)化.比較了加入不等量樣品處理后的啶氧菌酯的回收率如圖3所示.由圖3可知,加入3.0 g、3.5 g、5.0 g樣品時,啶氧菌酯的回收率較低,可能是因為樣品與水混合后混合液的分散程度過小或者過大,影響了分散吸附劑對雜質(zhì)的吸附過程,啶氧菌酯的回收率低;而加入樣品4.0 g和4.5 g時,啶氧菌酯都能很好地回收,加樣4.0 g時的回收率稍大于加樣4.5 g的,故選擇最優(yōu)添加樣品量為4.0 g.

(4)加水量的優(yōu)化.通過加水改變樣品顆粒的分散程度,從而對目標(biāo)物的回收產(chǎn)生了一定的影響如圖4所示.由圖4可知,凈化過程中加水量的多少對啶氧菌酯的回收率影響很大.加水量為6 m L、8 m L和12 m L時目標(biāo)物的回收率偏小,這可能是因為樣品的分散程度太小或太大,影響了凈化吸附過程;加水量在10～12 m L范圍內(nèi)小麥中啶氧菌酯的回收率較高,加10 m L水時回收率稍大于加12 m L水處理的樣品.故選擇前處理過程中加10 m L水浸潤樣品.

2.2 啶氧菌酯標(biāo)準曲線的繪制

以峰面積為橫坐標(biāo),啶氧菌酯的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),在0.05～1.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)繪制標(biāo)準曲線,經(jīng)計算其線性回歸方程為:Y＝3.06×10－5X－1.50×10－3,R2＝0.9999,表明0.05～1.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),色譜峰面積與啶氧菌酯的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,可以滿足定量分析的要求.當(dāng)信噪比＝3時,算得小麥中啶氧菌酯的最小檢出限為0.018 mg/L.質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的啶氧菌酯標(biāo)準液的色譜圖如圖5所示.由圖5可知,其理論塔板數(shù)為4 421,柱效較好,啶氧菌酯的保留時間為11.37 min.

2.3 方法的重復(fù)性實驗

取小麥粉樣品,按上述1.3(4)⑤方法進行測定,結(jié)果如表1所示.由表1可知,該方法具有良好的重復(fù)性和精密度.

2.4 方法的回收率實驗

方法的回收率實驗結(jié)果如表2所示.由表2可知,啶氧菌酯在小麥中的添加回收率范圍為86.52%～91.23%,平均回收率為89.05%,變異系數(shù)范圍為3.22%～6.19%.小麥粉中啶氧菌酯添加水平為1.0 mg/L時的添加回收色譜圖如圖6所示.

表1 方法的重復(fù)性實驗結(jié)果

表2 方法的回收率實驗結(jié)果

2.5 小麥樣品的測定

準確稱取小麥樣品在選定最佳實驗條件下進行檢測,結(jié)果未檢出.

3 結(jié)論

基質(zhì)分散固相萃取-高效液相色譜法測定小麥中的啶氧菌酯,在樣品前處理操作中進行了優(yōu)化,快速簡便,方法重現(xiàn)性較好.加標(biāo)回收率在86.52%～91.23%之間,重復(fù)性實驗RSD為3.34%,最低檢出限為0.018 mg/L,說明測量儀器系統(tǒng)性能好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、且檢測限低,已達到農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的要求.在實際小麥樣品檢測中未檢出啶氧菌酯,未來可用于小麥中啶氧菌酯的監(jiān)測.

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Determination of picoxystrobin in wheat by modified QuEchERS-HPLC

XIE Fei-fei,HUANG Xiao-dong?,LU Jian,ZHANG Fei
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

A modified QuEch ERS-HPLC method was established for quantitative determination of picoxystrobin wheat.The sample preparation was completed for the extraction and clean-up steps with the modified QuEchERS method,then it was centrifugated and filtered before detection by HPLC-DAD.The mobile phase was a 65∶35(by vol)mixture of acetonitrile and water,the flow rate was 1.0 m L/min,and a wondasil C18-WR column(5μm,250 mm×4.6 mm)was used with column temperature of 30℃.Good linearity of picoxystrobin was obtained over the range of 0.05～1.0 mg/L (R＝0.999 9),the variation coefficient was 3.34%,and the average recovery was 89.32%.The method was an ideal analysis method with the advantages of convenience,fast speed and good repeatability, which can be used for the quantitative detection and analysis of picoxystrobin in wheat.

HPLC;Qu Ech ERS;picoxystrobin;wheat

TS206

A

1672-2477(2015)05-0008-05

2015-09-11

謝飛飛(1989-),女,安徽淮北人,碩士研究生.

黃曉東(1963-),男,安徽蕪湖人,副教授,碩導(dǎo).