孫霞,鞏洋,楊勇,曾建華,劉濤,楊敏,卿丹丹,李靜
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安,625014)
香腸是我國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品之一,川味香腸因具有色亮、味美、爽口等特點(diǎn),在國(guó)內(nèi)較為有名。川味香腸主要通過(guò)自然發(fā)酵,發(fā)酵微生物來(lái)源于環(huán)境中混入的雜菌和肉中有益菌與雜菌競(jìng)爭(zhēng)形成的優(yōu)勢(shì)菌群,而其可能具有氨基酸脫羧酶活性,導(dǎo)致川味香腸中氨基酸脫羧形成生物胺。生物胺(biogenic amines,BA)是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有機(jī)化合物[1],過(guò)量生物胺會(huì)引起血管擴(kuò)張,導(dǎo)致人體的不良反應(yīng),因此對(duì)香腸加工過(guò)程中生物胺含量變化進(jìn)行研究具有重要意義。
生物胺的含量受多種因素影響,如溫度、濕度、pH、發(fā)酵劑的種類和數(shù)量等[2-3]。一般通過(guò)接種單一或者混合發(fā)酵劑以及篩選具有胺氧化酶的菌株等來(lái)控制香腸中生物胺[4-7]。有研究發(fā)現(xiàn),香腸pH值較低,能抑制氨基酸脫羧酶陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng),從而降低香腸中生物胺積累[8]。帥瑾[9]通過(guò)接種植物乳桿菌和葡萄球菌生產(chǎn)川式薩拉米香腸,pH值較低,但與傳統(tǒng)川味香腸的口感差異很大,很難滿足當(dāng)?shù)厝嗣竦娘嬍沉?xí)慣。生物胺的積累與溫濕度存在復(fù)雜的關(guān)系,而不是簡(jiǎn)單地呈正相關(guān)或反相關(guān)[10];另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),較高發(fā)酵溫度適宜乳酸菌生長(zhǎng),能提高乳酸菌對(duì)生物胺合成菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),從而降低香腸中生物胺的含量[11];還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌和微球菌具有產(chǎn)生物胺氧化酶的能力,接種此類發(fā)酵劑不但可以提升香腸的風(fēng)味,還能降低香腸中生物胺的含量[12]。因此可以通過(guò)選擇合適的溫濕度條件和發(fā)酵劑協(xié)同作用來(lái)抑制香腸中生物胺的積累。
本研究通過(guò)以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediocossus pentosaceus)、葡萄球菌(Staphylococcus)作為發(fā)酵劑,采用智能化控溫控濕現(xiàn)代工藝生產(chǎn)低酸度川味香腸,研究其加工過(guò)程中pH值、氨基酸態(tài)氮和生物胺含量的變化,評(píng)價(jià)發(fā)酵劑應(yīng)用安全性,找出適宜的應(yīng)用條件,為川味香腸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。
葡萄球菌(Staphylococcus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖片球菌(Pediocossus pentosaceus)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品研究室從傳統(tǒng)自然發(fā)酵川味香腸中分離得到[9,13]。新鮮豬后腿肉、腸衣、辣椒、花椒和食鹽等調(diào)味料均購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺及丹磺酰氯均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;乙腈和丙酮為色譜純;HCl、氨水、NaOH、Na2CO3等均為分析純;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制(Milli-Q,Millipore)。
LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海榮豐科學(xué)儀器有限公司;ST16R高速冷凍離心機(jī),北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋,上海一恒公司;BMS602型均質(zhì)機(jī),德國(guó)BRT公司;海爾冰箱;電子天平;高效液相色譜儀(島津LC-2010CHT);超聲波清洗器(KH5200B型);PHS-3C型酸度計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SW-GJ-IFD型超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)泰安公司。
參照張雪梅[14]的配方:豬肉100 kg(皮下脂肪20 kg,瘦肉 80 kg),食鹽 2.5 kg,辣椒粉 1.0 kg,花椒粉 0.4 kg,白砂糖 1.0 kg,味精 0.15 kg,白酒 1.0 kg,十三香 0.05 kg,NaNO30.025 kg,NaNO20.007 5 kg。
工藝流程:原料肉→預(yù)處理→絞碎→添加配料→接種→混合→灌腸→發(fā)酵→成熟→干燥→成品
發(fā)酵劑的制作:30℃下液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株14 h后,置于4℃下4 000 r/min冷凍離心10 min,用無(wú)菌生理鹽水洗滌1次再離心,收集菌體并適量稀釋,運(yùn)用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),接種量為106CFU/g,植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌按1∶1∶1的比例混合加入。
本研究在單因素和正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定低酸度川味香腸的工藝參數(shù):發(fā)酵溫度20℃,發(fā)酵相對(duì)濕度75%,發(fā)酵時(shí)間12 h,葡萄糖添加量0.10%;成熟溫度13℃,成熟相對(duì)濕度60%,成熟時(shí)間4 d;干燥溫度55℃,干燥時(shí)間24 h。
實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)處理,以字母A、B、C、D表示。A是接種混合發(fā)酵劑并在控溫控濕條件下生產(chǎn)的低酸度川味香腸;B是不接種混合發(fā)酵劑但在控溫控濕條件下生產(chǎn)的川味香腸;C是接種混合發(fā)酵劑在自然條件 (溫度為8~15℃,相對(duì)濕度為75% ~90%)下生產(chǎn)的川味香腸;D是不接種混合發(fā)酵劑在自然條件(溫度為8~15℃,相對(duì)濕度為75% ~90%)下生產(chǎn)的傳統(tǒng)川味香腸。
取川味香腸在加工過(guò)程中的7個(gè)工藝點(diǎn),0 h(原料肉)、12 h(發(fā)酵結(jié)束)、36 h(成熟 1 d)、60 h(成熟2 d)、84 h(成熟 3 d)、108 h(成熟 4 d)、132 h(干燥結(jié)束)的香腸作為指標(biāo)測(cè)定樣品。
1.4.1 pH的測(cè)定
參照GB/T9695.5—2008。取10 g樣品4 000 r/min均質(zhì)2 min,加入90 mL蒸餾水,浸提30 min,過(guò)濾,濾液用酸度計(jì)測(cè)定。
1.4.2 氨基酸態(tài)氮測(cè)定
采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定[15]。
1.4.3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和衍生
稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺各50 mg,用0.1 mol/L HCl定容到50 mL,在4℃冰箱避光保存。吸取單標(biāo)儲(chǔ)備液,置于10 mL容量瓶,用0.1 mol/L HCl稀釋成濃度為:0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在4℃冰箱避光保存。
取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加200 μL 2 mol/L NaOH使之呈堿性,再加入300 μL飽和NaHCO3溶液緩沖,室溫下反應(yīng)30 min,然后加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液,在40℃下處于黑暗中反應(yīng)45 min后加入100 μL的NH4OH終止反應(yīng),室溫下暗反應(yīng)30 min,去除殘留丹磺酰氯溶液,加入乙腈使終體積為5 mL。衍生處理后0.22 μm濾膜過(guò)濾,用于分析檢測(cè)。
1.4.4 樣品處理
取5 g香腸加入20 mL 0.1 mol/L的HCl,勻漿機(jī)上徹底勻漿,冷凍離心機(jī)(4℃,4 000 r/min)離心10 min,沉淀部分如前的方法再重新提取1次。取2次的上清液用0.1 mol/L的HCl定容到50 mL,取1 mL的樣液如1.4.3中的方法進(jìn)行衍生。
1.4.5 色譜條件
色譜柱為 C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm),流速 1 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm,進(jìn)樣量 10 μL,柱溫30℃,流動(dòng)相A為H2O,流動(dòng)相B為乙腈,采用梯度洗脫程序,見(jiàn)表1。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program
川味香腸加工過(guò)程中pH值的變化如圖1所示。A組pH值呈先下降后上升的趨勢(shì),B、C和D組pH值變化不顯著(P>0.05)。在發(fā)酵期(0~12 h),A組pH值迅速下降(P<0.01),是因?yàn)锳組接種了植物乳桿菌和戊糖片球菌,在適宜溫度下乳酸菌生長(zhǎng)繁殖,分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸。C組和D組pH值變化不顯著,可能是因?yàn)榄h(huán)境溫度較低,乳酸菌生長(zhǎng)受到抑制。在成熟前期(12~60 h),A組pH值迅速下降,是因?yàn)殡m然溫度和相對(duì)濕度下降,但香腸中心溫度還未達(dá)到成熟溫度,乳酸菌還在繼續(xù)生長(zhǎng)。在成熟后期(60~108 h),A組pH值緩慢下降(P>0.05),是因?yàn)榄h(huán)境溫度較低,抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)。在干燥期(108~132 h),4組香腸pH值均呈略微上升趨勢(shì)(P>0.05),這是由于環(huán)境溫度較高促使蛋白質(zhì)不斷降解產(chǎn)生堿類物質(zhì)。
圖1 低酸度川味香腸加工過(guò)程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH in low acidity Sichuan-style sausage during processing
在川味香腸加工過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的變化如圖2所示。氨基酸態(tài)氮呈上升趨勢(shì)(P<0.05)。在發(fā)酵期(0~12 h),A組和B組氨基酸態(tài)氮含量明顯高于C組和D組(P<0.01),這可能是由于微生物在較高的發(fā)酵溫度下產(chǎn)生蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)降解,使香腸中氨基酸態(tài)氮含量提高。
圖2 低酸度川味香腸加工過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的變化Fig.2 Changes of amino acidic nitrogen in low acidity Sichuan-style sausage during processing
在整個(gè)成熟(12~108 h)過(guò)程中,4組香腸氨基酸態(tài)氮變化不顯著(P>0.05),這可能是由于成熟溫度較低,抑制了微生物活動(dòng)和組織蛋白酶活性使蛋白質(zhì)降解作用降低,此外部分氨基酸態(tài)氮參與了川味香腸風(fēng)味的形成,自身被消耗。在干燥期(108~132 h),4組香腸氨基酸態(tài)氮含量迅速上升(P<0.01),這可能是因?yàn)楦稍锲谒趾拷档?,使氨基酸態(tài)氮相對(duì)濃度增大,也可能是因?yàn)樗稚⑹?dǎo)致食鹽含量增加,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,使蛋白酶更易作用于蛋白質(zhì)[16]。干燥結(jié)束時(shí),A、B、C和D組氨基酸態(tài)氮分別為0.215%、0.237%、0.193%和0.185%,4組差異不顯著(P>0.05),這可能是由于4組香腸經(jīng)過(guò)快速干燥水分散失量大,氨基酸相對(duì)干基含量區(qū)別不顯著。
圖3是生物胺混合標(biāo)樣的色譜圖。由圖3可見(jiàn),本實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC方法,可將溶劑峰及雜質(zhì)峰在前5 min內(nèi)全部洗脫出。而7種生物胺均能在20 min內(nèi)有效分離,采用該方法具有較好的分離效果。從表2可以看出,7種生物胺的峰面積與其相應(yīng)的濃度分別呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,通過(guò)該方法可準(zhǔn)確測(cè)定出生物胺的含量。
圖3 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)HPLC色譜圖Fig.3 The HPLC chromatogram for a standard mixture of biogenic amines
表2 七種生物胺回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and correlation coefficients of seven biogenic amines
2.4.1 四組川味香腸中的生物胺含量
4組川味香腸中7種生物胺含量如表3所示。4組香腸的生物胺總量在61.981~107.852 mg/kg,A組生物胺總量顯著低于B、C、D組(P<0.01),由于A組較低的pH值抑制了生物胺的積累;B組生物胺總量最高,為107.852 mg/kg,這可能是由于B組的溫度較高,增強(qiáng)了蛋白酶的活性,促進(jìn)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生生物胺。4組香腸的生物胺,除亞精胺外,其余生物胺含量差異顯著(P<0.01),A組香腸中色胺、苯乙胺、腐胺、組胺和酪胺含量均顯著低于B、C、D組(P<0.01),說(shuō)明混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件下對(duì)其抑制作用顯著。4組香腸的生物胺含量均較低,未超過(guò)FDA相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。
表3 四組川味香腸中的生物胺含量 單位:mg/kgTable 3 The content of biogenic amines in four kinds of Sichuan-style sausage
2.4.2 色胺含量的變化
在川味香腸加工過(guò)程中色胺含量呈緩慢增加趨勢(shì),見(jiàn)圖4。在發(fā)酵期(0~12 h),4組香腸色胺含量變化不明顯(P>0.05);在成熟期(12~108 h),4組香腸色胺含量均呈上升趨勢(shì),其中B組和D組變化顯著(P<0.01),這可能是由于B組較高的溫濕度更有利于蛋白質(zhì)的降解,D組在自然條件下可能侵入了某些能夠產(chǎn)生色氨酸脫羧酶的微生物,導(dǎo)致色胺的積累;在干燥期(108~132 h),4組香腸色胺含量均呈上升趨勢(shì),且C組變化最為明顯(P<0.01),這可能是由于自然環(huán)境中微生物與接種的混合發(fā)酵劑競(jìng)爭(zhēng)形成優(yōu)勢(shì),在較高的溫度下使色氨酸脫羧產(chǎn)生色胺;干燥結(jié)束時(shí),B組和D組色胺含量分別達(dá)到了6.362 5 mg/kg和5.845 0 mg/kg顯著高于A組(3.211 5 mg/kg),而與C組(5.065 1 mg/kg)差異不顯著(P>0.05),這可能是由于混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件下生長(zhǎng)產(chǎn)生了酸類物質(zhì)降低了pH抑制了色胺的積累,這與譚李紅[17]等研究結(jié)果相似,說(shuō)明混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件能夠抑制色胺的積累。
2.4.3 苯乙胺含量的變化
在川味香腸加工過(guò)程中的苯乙胺含量呈增加的趨勢(shì),見(jiàn)圖5。在發(fā)酵期(0~12 h),B組和D組苯乙胺快速增加(P<0.01),而 A組增加量較少(P>0.05),這可能是由于A組接種的混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件下生長(zhǎng)產(chǎn)生了酸類物質(zhì)降低了pH抑制了苯乙胺的積累;在成熟期(12~108 h),4組香腸苯乙胺含量均呈上升趨勢(shì),其中B組變化最為明顯(P<0.01);在干燥期(108~132 h),A組苯乙胺積累較少,B組苯乙胺積累最多,這可能是由于B組長(zhǎng)期處于適宜的溫濕度環(huán)境導(dǎo)致氨基酸脫羧酶不斷脫羧形成苯乙胺;干燥結(jié)束時(shí),B組和C組中苯乙胺含量變化最為明顯(P<0.01),由原料肉的1.319 5 mg/kg增加到24.817 7 mg/kg和16.332 3 mg/kg,A組和D組雖然也呈上升趨勢(shì),但A組的含量(8.037 2 mg/kg)顯著低于B組和C組,說(shuō)明混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件下能顯著抑制苯乙胺的積累(P<0.01)。
圖4 低酸度川味香腸加工過(guò)程中色胺含量的變化Fig.4 Changes of amino tryptamine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
圖5 低酸度川味香腸加工過(guò)程中苯乙胺含量的變化Fig.5 Changes of amino phenylethylamine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
2.4.4 腐胺含量的變化
在川味香腸加工過(guò)程中腐胺含量呈明顯增加趨勢(shì)(P<0.01),見(jiàn)圖6。在發(fā)酵期(0~12 h),4組香腸腐胺含量變化不明顯,A組腐胺含量與其他3組差異不顯著(P>0.05),是由于混合發(fā)酵劑對(duì)腐胺抑制效果不明顯;在成熟期(12~108 h),4組香腸腐胺含量均呈上升趨勢(shì)且4組香腸間差異不明顯(P>0.05);在干燥期(108~132 h),4組香腸腐胺含量均呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.01),這可能是由于較高溫度促使精氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧產(chǎn)生腐胺,且B組和D組增加量顯著高于A組和C組(P<0.01);干燥結(jié)束時(shí),B組和D組中腐胺含量分別為17.139 8 mg/kg和16.113 3 mg/kg顯著高于A組(10.360 3 mg/kg)和C組(11.977 2 mg/kg),說(shuō)明混合發(fā)酵劑對(duì)腐胺有一定的抑制效果。
圖6 低酸度川味香腸加工過(guò)程中腐胺含量的變化Fig.6 Changes of amino putrescine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
2.4.5 尸胺含量的變化
在川味香腸加工過(guò)程中尸胺含量呈增加趨勢(shì),見(jiàn)圖7。在發(fā)酵期(0~12 h),4組香腸尸胺含量變化不明顯,A組尸胺含量與其他3組差異不顯著(P>0.05),這可能是由于混合發(fā)酵劑對(duì)尸胺抑制效果不明顯;在成熟期(12~108 h),4組香腸尸胺含量均呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.01),B組中尸胺含量均高于其他3組,是由于較高溫度促使賴氨酸不斷脫羧產(chǎn)生尸胺;在干燥期(108~132 h),4組香腸尸胺也呈不斷上升趨勢(shì),但A組上升趨勢(shì)不明顯(P>0.05),是由于A組在成熟結(jié)束時(shí)pH較低,抑制了部分氨基酸脫羧酶活性;干燥結(jié)束時(shí),A、B、C和D組香腸中尸胺含量差異不顯著(P>0.05),分別為11.483 5、15、692 3、14.389 4和14.697 6 mg/kg,說(shuō)明混合發(fā)酵劑對(duì)尸胺有沒(méi)有顯著抑制效果(P>0.05),這與馬宇霞[18]等研究發(fā)酵劑對(duì)熏馬腸成熟過(guò)程中生物胺含量變化的尸胺含量影響的結(jié)果相似。
圖7 低酸度川味香腸加工過(guò)程中尸胺含量的變化Fig.7 Changes of amino cadaverine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
2.4.6 組胺含量的變化
在川味香腸加工過(guò)程中組胺含量呈增加趨勢(shì),見(jiàn)圖8。在發(fā)酵期(0~12 h),除B組外,其他3組香腸含量變化不明顯(P>0.05);在成熟前期(12~60 h),4組香腸組胺含量呈緩慢上升趨勢(shì),是由于成熟前期香腸中組氨酸含量比較低;在成熟后期(60~108 h),4組香腸組胺均呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.01),這可能是由于時(shí)間延長(zhǎng),蛋白質(zhì)不斷分解產(chǎn)生組氨酸,組氨酸進(jìn)一步分解產(chǎn)生組胺;在干燥期(108~132 h),組胺的變化與成熟后期的趨勢(shì)一致;干燥結(jié)束時(shí),A組香腸中組胺含量顯著低于其他3組,而C組與B、D組差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件下能顯著抑制組胺的積累(P<0.01)。
圖8 低酸度川味香腸加工過(guò)程中組胺含量的變化Fig.8 Changes of amino histamine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
2.4.7 酪胺含量的變化
在川味香腸加工過(guò)程中酪胺含量呈增加趨勢(shì),見(jiàn)圖9。在發(fā)酵期(0~12 h),4組香腸中酪胺均呈緩慢上升趨勢(shì),是由于原料肉中本身帶有的微生物具有氨基酸脫羧酶分解酪氨酸產(chǎn)生酪胺;在成熟期(12~108 h),4組香腸酪胺含量均呈上升趨勢(shì),且B組積累較多,是由于B組的溫濕度條件能增加氨基酸脫羧酶活性;在干燥期(108~132 h),酪胺含量也呈上升趨勢(shì)(P<0.01),是由于較高溫度促使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸;干燥結(jié)束時(shí),A組酪胺含量(16.227 8 mg/kg)低于其他3組,說(shuō)明混合發(fā)酵劑能抑制酪胺的積累。
圖9 低酸度川味香腸加工過(guò)程中酪胺含量的變化Fig.9 Changes of amino tyramine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
2.4.8 亞精胺含量的變化
亞精胺是原料肉中常見(jiàn)的生物胺,始終存在于川味香腸中,加工過(guò)程中亞精胺含量的變化如圖10所示。在川味香腸發(fā)酵、成熟和干燥過(guò)程中,亞精胺含量比較穩(wěn)定,基本維持在3.7~5.1 mg/kg,說(shuō)明成熟時(shí)間、溫濕度和混合發(fā)酵劑對(duì)亞精胺的含量影響不顯著(P>0.05)。這與朱志遠(yuǎn)[19]等研究不同發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸中生物胺的影響的結(jié)果是相似的。
圖10 低酸度川味香腸加工過(guò)程中亞精胺含量的變化Fig.10 Changes of amino spermidine in low acidity Sichuan-style sausage during processing
通過(guò)接種植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌并在智能化控溫控濕條件下生產(chǎn)的低酸度川味香腸,干燥結(jié)束時(shí),其色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺均低于B組、C組和D組,其中色胺、苯乙胺、腐胺、組胺和酪胺均顯著低于B組(P<0.01),B組的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺均高于A組、C組和D組;四組川味香腸的亞精胺的含量差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明:混合發(fā)酵劑在適宜的溫濕度條件下能顯著抑制低酸度川味香腸中色胺、苯乙胺、腐胺、組胺和酪胺的積累(P<0.01),而對(duì)尸胺的抑制作用不顯著(P>0.05)。
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