RNAi表達載體在哺乳動物中的研究進展

侯瑩，成志云，王立強，許瑞安，唐明青

（華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州362021）

RNA 干擾（RNAi）是一種由19～29個核苷酸（nt）非編碼RNA（ncRNA）引起的靶基因特異性沉默效應(yīng)，已發(fā)展成為基因調(diào)控的最有效技術(shù)之一.RNAi表達載體是一種能攜帶和表達目的小RNA“基因”的荷載介質(zhì)，能夠很好地彌補化學(xué)合成型RNAi的不足，實現(xiàn)RNAi分子的長效、安全、可控性表達，為個體化和靶向性基因治療奠定了基礎(chǔ)，已被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控、功能分析、疾病診斷和基因治療等方面［1－3］.鑒于此，本文以哺乳動物為基礎(chǔ)，對已知RNAi表達載體的發(fā)生發(fā)展、構(gòu)成、作用機制、遞送系統(tǒng)及主流應(yīng)用做一個較為全面的綜述.

1 發(fā)展與分類

1.1 發(fā)生發(fā)展

2002年，Brummelkamp等［4］首次將小干擾RNA（siRNA）嵌入至短發(fā)夾式骨架中表達，發(fā)現(xiàn)其對目的siRNA 的表達長久而高效，成功構(gòu)建了第一個RNAi表達載體（短發(fā)夾RNA 表達載體、shRNA載體），標(biāo)志著第一代RNAi表達載體的誕生.但隨著研究的深入，shRNA 載體存在的脫靶效應(yīng)［5－6］、細胞毒性和干擾內(nèi)源性miRNA 通路［7］等問題極大地限制了shRNA 載體的發(fā)展.于是，Zeng等［5］通過模擬內(nèi)源性miRNA 的發(fā)生通路，成功構(gòu)建了第二代RNAi表達載體（人工微小RNA 表達載體、amiRNA載體），并發(fā)現(xiàn)其與原始shRNA 載體相比，具有組織特異性強、毒性低、時間及沉默水平可控等優(yōu)點.

隨著基因治療的快速發(fā)展，開發(fā)安全、可控、高效的RNAi表達載體日益重要.在shRNA 載體方面，可以通過載體表達框的優(yōu)化（如發(fā)夾環(huán)的序列、結(jié)構(gòu)和大小等）提高載體的安全性和沉默效率［8－9］.近期發(fā)展起來的雙功能shRNA 表達載體借助RNAi的旁路途徑促進主體RNAi的進行，顯著提高了基因沉默效率，弱化了脫靶效應(yīng)，是目前shRNA 載體的一種新形式［10］.在amiRNA 載體方面，提高載體表達效率及靶向性、擴充載體使用范圍一直是研究的重點，如改造表達骨架的前體結(jié)構(gòu)，在套索結(jié)構(gòu)兩側(cè)增添互補堿基，或使側(cè)翼序列錯配等［11－12］，顯著提高了目的小RNA 在體內(nèi)的表達效率及沉默效果.鑒于表達骨架的種屬特異性及進化保守性，以鼠源［13］、雞源［14］為表達骨架的研究也在不斷開展，均實現(xiàn)了靶基因的有效沉默，為amiRNA 表達載體的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1.2 系統(tǒng)分類

目前，RNAi表達載體并沒有公認的分類標(biāo)準，學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界存在多種不同的叫法，如小干擾RNA（siRNA）載體［15］、短發(fā)夾RNA（shRNA）載體［4］、微小RNA（miRNA）載體［16］、人工微小RNA（amiRNA）載體［5］、shRNAmir載體［17］等.各種載體之間的區(qū)別與聯(lián)系，各自載體的范圍和特性的界定成為當(dāng)前的一大問題，尤其是第一代和第二代載體之間的具體劃分標(biāo)準依然不明確，這將直接干擾今后載體的選擇和優(yōu)化.

2 構(gòu)成與構(gòu)建及其作用機制

2.1 構(gòu)成與構(gòu)建

RNAi表達載體一般由啟動子、表達框及輔助元件構(gòu)成.其中，表達框是整個載體的核心，包含目的小RNA 和表達骨架兩部分，前者由正義鏈和反義鏈構(gòu)成，后者由連接目的小RNA 的套索序列及側(cè)翼序列構(gòu)成.RNAi表達載體的代表性研究，如表1所示.

表1 RNAi表達載體的代表性研究Tab.1 Representative researches about RNAi expression vector

目前，RNAi表達載體的構(gòu)建主要有“串聯(lián)法”和“并聯(lián)法”.前者主要針對siRNA 載體，由兩個獨立的啟動子完成兩條串聯(lián)的目的小RNA 單鏈序列的分別表達，對表達骨架依賴性低（或完全不需要），但構(gòu)建過程復(fù)雜且表達效果欠佳，目前應(yīng)用相對較少，構(gòu)建過程如圖1（a）所示.后者主要針對shRNA 載體、amiRNA 載體及miRNA 載體，通常由單一啟動子完成發(fā)夾式目的小RNA 序列的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建過程簡單，但對表達骨架依賴性強，需要合適的表達骨架方可實現(xiàn)目的小RNA 的理想表達，是目前主流的載體構(gòu)建方法，構(gòu)建過程如圖1（a）所示［4，8］.

2.2 作用機制

RNAi表達載體在體內(nèi)發(fā)揮干擾作用主要通過內(nèi)源性通路和外源性通路兩條途徑［21］.前者主要為miRNA 和amiRNA 載體作用通路，通常由組織特異性Pol－II啟動子誘導(dǎo)miRNA／amiRNA 的初級產(chǎn)物（Pri－miRNA／Pri－amiRNA）形成，在Drosha 酶的作用下形成miRNA／amiRNA 的前體結(jié)構(gòu)（PremiRNA／Pre－amiRNA），由出核蛋白（Exportin－5）運輸至細胞質(zhì)，并在Dicer酶的加工下形成成熟的miRNA／amiRNA，在與RISC－AGO 復(fù)合體的共同作用下調(diào)控靶mRNA 的翻譯（圖1（b））［9］.后者為shRNA 與siRNA 載體的作用通路，一般由Pol－Ⅲ啟動子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，形成siRNA 的前體結(jié)構(gòu)（shRNA），之后在胞質(zhì)內(nèi)由Dicer類似酶加工形成成熟的siRNA（而siRNA 載體轉(zhuǎn)錄后直接生成成熟的siRNA），隨后在RISC－AGO 復(fù)合體的共同作用下發(fā)揮降解靶mRNA 的作用［21］（圖1（b））.

圖1 RNAi表達載體的構(gòu)成構(gòu)建與作用機制Fig.1 Construction and mechanism of RNA interference expression vector

3 遞送系統(tǒng)

3.1 非生物載體

納米顆粒是目前研究較多的非生物遞送載體，具有免疫原性低、可被生物體自動分解等特點［22］.近期，有研究者采用納米顆粒載體遞送靶向VEGF－A 的shRNA 質(zhì)粒載體，用于抗角膜血管生成，通過基質(zhì)內(nèi)注射的方法直接作用于病灶部位，成功抑制了血管生成基因的表達［23］.另外，最近的一項研究顯示，納米顆粒遞送有望實現(xiàn)抗腫瘤shRNA 質(zhì)粒載體的口服遞送［24］，為口服基因治療奠定了基礎(chǔ).

3.2 細菌載體

近年來，細菌載體被創(chuàng)新性地拉入了RNAi表達載體的遞送系統(tǒng)行列［25］.早期細菌介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在線蟲體內(nèi)應(yīng)用較多，隨后有報道稱治療性細菌能夠通過脈管系統(tǒng)進入腫瘤細胞［26］.基于此，有研究者將重新構(gòu)建的大腸桿菌用于哺乳動物細胞中shRNA 的遞送，目前，以此遞送系統(tǒng)為基礎(chǔ)的一項治療遺傳性結(jié)腸癌的項目正處于臨床檢測階段［27］.除此之外，減毒鼠傷寒桿菌亦可用于遞送shRNA 載體，通過靶向腫瘤細胞表面受體，減少了腫瘤的負荷，提高了受試動物的存活率［28］.

3.3 病毒載體

病毒載體是RNAi表達載體中應(yīng)用最為廣泛的遞送系統(tǒng)，主要包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒等.其中，腺病毒在基因治療的臨床試驗中應(yīng)用較廣，但腺病毒自身可高度表達非編碼RNA，干擾RNAi通路的正常進行［29］.此外，腺病毒是一類游離型遞送系統(tǒng)，只能進行瞬時爆發(fā)性表達.

與之相比，腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的RNAi則較為穩(wěn)定，無明顯致病性，而且RNAi表達框普遍短小的特點正好彌補了此類遞送系統(tǒng)包裝容量小的缺陷.此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒與慢病毒均可整合入宿主基因組進行長期表達，在穩(wěn)定性RNAi效應(yīng)中頗受偏愛［30］，對全基因組篩選及基因文庫的構(gòu)建做出了巨大貢獻，但其安全性有待進一步完善.

4 主流應(yīng)用

4.1 RNAi文庫

RNAi文庫是人工構(gòu)建且通過RNAi抑制眾多不同基因表達的混合文庫，可用于功能缺陷型生物或細胞庫的構(gòu)建及表型篩選.隨著RNAi表達載體的發(fā)展，RNAi文庫構(gòu)建中存在的細胞類型限制以及基因沉默持久度的問題均得到了很好的解決，使RNAi文庫在植物及哺乳動物基因組的研究中［18］，尤其在腫瘤細胞多藥耐藥性［31］、特異性藥物靶點選擇［32］等方面得到了廣泛地應(yīng)用.

目前，基于RNAi表達載體的RNAi文庫資源，如表2所示.近期，一項RNAi的“傳感器實驗”使強效的shRNA 分子的大量平行識別成為了可能，并為amiRNA 型RNAi文庫的功能性確認提供了新的策略［33］.

表2 基于RNAi表達載體的RNAi文庫資源Tab.2 Available sources of RNAi library based on RNAi expression vectors

4.2 單基因調(diào)控

RNAi表達載體通過轉(zhuǎn)錄獲得的功能性序列抑制單基因表達在基因功能研究方面發(fā)揮著重要作用，尤其為當(dāng)前無明顯藥物治療效果的疾病提供了一種治療策略.例如，Zhou等［37］對宮頸癌的發(fā)病機理進行體外研究，采用shRNA 靶向沉默人類乳頭瘤病毒原癌基因E6和E7，導(dǎo)致p53及pRB蛋白大量積累，MCM7和p16蛋白減少，癌細胞的增殖和擴散能力顯著降低，揭示了E6和E7基因在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中的重要作用，展現(xiàn)了shRNA 表達載體在基因功能研究中的巨大潛力.但良好的設(shè)計是效應(yīng)分子發(fā)揮高效沉默的前提，在此基礎(chǔ)上采用多個shRNA 載體分子靶向同一基因［38］，可有效避免非靶向性沉默的發(fā)生，使RNAi表達載體的應(yīng)用更加安全可靠.

4.3 轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因動物是RNAi表達載體的另一創(chuàng)新性應(yīng)用.目前已成功構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動物主要有轉(zhuǎn)基因大鼠、小鼠、豬、羊等，其中，前兩者在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較廣.早期，采用shRNA 表達載體構(gòu)建基因敲除小鼠，存在嚴重的脫靶效應(yīng)及細胞毒性［19］，目前已逐漸被amiRNA 表達載體所替代，增加了模型的可誘導(dǎo)性及基因沉默的可逆轉(zhuǎn)性，為不同品系轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)［39］.轉(zhuǎn)基因動物成功構(gòu)建的關(guān)鍵在于強效的RNAi效應(yīng)分子及穩(wěn)定的表達系統(tǒng).近期，Dow 等［40］通過優(yōu)化以miR－30 為表達骨架的amiRNA 表達載體和amiRNA 分子設(shè)計，同時結(jié)合重組酶介導(dǎo)的盒式策略（RMCE），進一步挖掘了有效轉(zhuǎn)基因小鼠品系的發(fā)展?jié)摿?，為轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建提供了一種快速、經(jīng)濟、高效的方法.

5 問題與展望

RNAi技術(shù)是繼反義寡核苷酸技術(shù)和基因敲除技術(shù)之后的又一重要的基因調(diào)控手段，也是目前最為普遍和常用的基因調(diào)控策略［1－3］.RNAi表達載體實現(xiàn)了干擾性小RNA 的長效、高效、安全和靶向性表達.但現(xiàn)有的RNAi表達載體還存在諸多問題：1）已被關(guān)注的shRNA 載體存在的細胞毒性和干擾內(nèi)源性miRNA 通路問題［5，7］，amiRNA 載體的種屬反應(yīng)性和表達效率問題［20］等；2）尚未重視的RNAi表達載體的分類界定，對目的小RNA 的表達保真性及有效性等問題.

以RNAi表達載體的系統(tǒng)分類為例，實質(zhì)上，第一代shRNA 表達載體和第二代amiRNA 載體都存在模擬內(nèi)源性miRNA 表達骨架的過程，只不過前者模擬程度較小，而后者是最大程度的模擬.由于對兩個劃時代的RNAi表達載體缺乏明確的劃分標(biāo)準，以致出現(xiàn)siRNA 載體、shRNA 載體、miRNA 載體、amiRNA 載體和shRNAmir載體等多套凌亂的分類名稱，這給將來的載體選擇和針對性載體優(yōu)化工作帶來潛在麻煩.因此，RNAi表達載體的系統(tǒng)分類不能僅憑其對內(nèi)源miRNA 表達骨架的模擬程度而定，也不能根據(jù)其自身的某一結(jié)構(gòu)組成來定，最好同時結(jié)合其結(jié)構(gòu)和功能進行系統(tǒng)分類.鑒于此，提出一種基于結(jié)構(gòu)組成和加工機制雙重屬性的載體系統(tǒng)分類方法：1）siRNA 載體－載體的表達框為成熟siRNA，直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生成熟siRNA；2）shRNA 載體－載體的表達框為shRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需經(jīng)Dicer類似酶加工產(chǎn)生成熟siRNA；3）amiRNA 或shRNAmir載體－載體的表達框為pri－siRNA（即pri－amiRNA），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需經(jīng)Drosha和Dicer類似酶加工產(chǎn)生成熟siRNA（即成熟amiRNA）；4）miRNA 載體－載體的表達框為pri－miRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需經(jīng)Drosha和Dicer酶加工產(chǎn)生成熟miRNA.

6 結(jié)論

對RNAi表達載體的非生物與生物遞送系統(tǒng)及基因調(diào)控、文庫構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因等主流應(yīng)用方面的研究進展進行綜述，對RNAi表達載體的結(jié)構(gòu)組成、發(fā)展沿革及體內(nèi)作用機制進行歸納分析，提出基于結(jié)構(gòu)組成和加工機制雙重屬性的分類方法.但是，該方法在實際操作中還存在一些問題：1）RNAi表達載體中各個組件之間或多或少地存在一定的連接序列，因此很難確定其表達框是shRNA 還是pri－miRNA；2）需要對每一個RNAi表達載體進行加工機制研究.因此，較為系統(tǒng)的命名方法有待研究的進一步深入而最終建立.

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