H9N2亞型禽流感病毒抗原性變異的研究

葛菲菲，劉 健，楊德全，李 鑫，鞠厚斌，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

H9N2亞型禽流感病毒抗原性變異的研究

葛菲菲，劉 健，楊德全，李 鑫，鞠厚斌，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

為了解不同年分離的H9N2亞型禽流感病毒（Avian infl uenza virus，AIV）之間的抗原相關性，挑選2002年、2006～2014年在上海市分離的14株H9N2亞型禽流感病毒，通過血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）交叉試驗進行抗原性比較和分析。HI試驗結果顯示，2002年，2006～2014年這14株H9N2亞型AIV不同毒株間已經發(fā)生了抗原漂移，劃分成4個不同的抗原群，A/Chicken/Shanghai/Y1/2002和A/Chicken/Shanghai/Y1/2006歸為一個抗原群，A/Chicken/Shanghai /C/2011獨自成為一個抗原群，A/Pigeon/Shanghai/JC1/2013、A/Chicken/Shanghai/1107/2013歸為同一個抗原群，其余毒株均為一個抗原群。綜上所述，隨著時間的推移，H9N2 AIV抗原發(fā)生了不同程度的漂變，但是也存在在某個時間段多種抗原群共存的情況。該研究結果從理論上為上海市制定禽流感防控策略，有效防制H9N2 AIV流行提供了科學的指導，為生產H9N2亞型流感免疫與疫苗候選毒株的選擇提供參考依據。

H9N2亞型禽流感病毒；交叉HI試驗；抗原漂移

H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）自20世紀90年代以來已經廣泛在我國和世界各地流行，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失，而且給公共衛(wèi)生安全造成的隱患不可估量，對人類的健康也構成了巨大的威脅。我國獨特的地理環(huán)境及養(yǎng)殖模式為AIV感染的發(fā)生、傳播提供了有利條件，免疫壓力及活禽市場的存在又為H9N2 AIV的重組和變異提供了必要條件［1］。目前，H9N2亞型的疫苗已用于常規(guī)免疫，在一定程度上控制了H9N2亞型AIV的暴發(fā)流行。但是，由于AIV傳播快，宿主具有多樣性，病毒株血清型眾多，不同毒株間毒力差異大，變異性強等特點，造成局部地區(qū)仍有流行，且非典型性流行增多，免疫失敗也屢見不鮮。Radu等［2］及Kilbourne等［3］指出疫苗株應經常改變，因為老的疫苗株通常僅對新毒株產生部分保護力。1999年，Garcia等［4］證實禽流感暴發(fā)期間AIV分離株有很高的變異性，從而導致疫苗無效。Suarez等［5］認為，AIV的變異可引起禽類甚至人類疫苗免疫的失敗。劉紅旗等［6］研究指出，HA基因的變異可能與頻繁的疫苗免疫選擇壓力有關。本研究通過HI交叉試驗來比較分析2002年、2006～2014年上海市分離的H9N2 AIV之間的抗原相關性，探討其抗原性是否發(fā)生漂移，為H9N2亞型禽流感的防制提供參考依據。

1. 材料和方法

1.1 病毒株和基因序列號 A/Chicken/Shanghai/ Y1/2002（GQ 335463～GQ 335470）、A/Chicken/ Shanghai/Y1/2006（GQ 335471～GQ 335478）、A/Duck/Shanghai/C60/2007（KC 768039～KC768046）、A/Chicken/Shanghai/Y1/2007（GQ 335487～ GQ 335494）、A/Chicken/Shanghai/ Y2/2008（GQ 335511～GQ335518）、A/Duck/ Shanghai/C163/2009（KC 768047～KC 768054）、A/Swine/Henan/Y1/2009（KC 768047、KC 768049、KC 768051、KC 768053、KC 768055、KC 768057、KC 768059和KC 768061）、A/ Chicken/Shanghai/A/2010（KJ 726689、KJ 726695、KJ 726701、KJ 7267007、KJ 726713、KJ 726719、KJ 726725和KJ 726731）、A/Chicken/ Shanghai/C/2011（KJ 726691、KJ 726697、KJ 726703、KJ 726709、KJ 726715、KJ 726721、KJ 726727和KJ 726733）、A/Chicken/Shanghai/ C1/2012（KC417046、KC 417049、KC 417052、KC417055、KC 417058、KC 417061、KC 417064和KC 417067）、A/Chicken/Shanghai/C2/2012（KC 417047、KC 417050、KC 417053、KC 417056、KC 417059、KC 417062、K C 4 1 7 0 6 5和K C 4 1 7 0 6 8）、A/P i g e o n/ Shanghai/JC1/2013（KJ128362～128369）、A/Chicken/Shanghai/1107/2013（KJ 726693、KJ 726699、KJ 726705、KJ 726711、KJ 726717、KJ726723、KJ 726729和KJ 726735）和A/ Wild chicken/ Shanghai/C1/2014（KJ 726694、KJ 726700、KJ 726706、KJ 726712、KJ 726718、KJ 726724、KJ 726730和KJ726736），上述14株病毒均為本實驗室分離保存。

1.2 主要儀器及試劑 孵化器購自EIFDM8646青島興儀電子設備公司；超低溫冰箱（MDF- U50V）購自日本SANYO公司；制冰機（FM-120D）購自美國星崎公司）；乳化器（FA25 Fluko）；離心機（5415D Eppendorf）；β-丙內酯購自上海西寶生物科技有限公司；菌檢用培養(yǎng)基由本實驗室制備。

1.3 SPF雞與SPF雞胚 SPF雞由中國農科院上海獸醫(yī)研究所提供；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.4 有限稀釋法純化 對1.1中14株H9N2 AIV分別應用有限稀釋法進行純化，吸取病毒尿囊液50μL加入到含青霉素1000 U/mL、鏈霉素1000 μg/mL的450 μLPBS中，依次進行10倍系列稀釋，然后以不同稀釋倍數(shù)的病毒液接種9～11日齡SPF雞胚，每枚100μL，平行3胚。接毒后雞胚繼續(xù)在孵化箱中孵育48 h后測定血凝，收取并保存最高稀釋倍數(shù)的具有最高血凝價的雞胚尿囊液，用于下一輪純化。如此連續(xù)經過3次純化后，把最后收取的尿囊液105稀釋，以100 μL接毒SPF雞胚，48 h收取尿囊液，混勻后分裝，-80℃保存，分裝的H9N2病毒液經鑒定無污染后用于后續(xù)實驗。為防止傳代過程中H9N2 AIV丟失及出現(xiàn)雜病毒的情況，對每一次收取的尿囊液進行血凝學及PCR鑒定，準確無誤后用于下一輪純化。

1.5 毒株的雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定 將病毒株用無菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-3～10-7個稀釋度，各尿囊腔接種10日齡SPF雞胚3個，每枚0.1 mL。37℃培養(yǎng)48 h后，逐個測定雞胚尿囊液HA價，HA效價≥4 log2判為感染，按Reed-Muench方法計算每0.1 mL的EID50。

1.6 滅活疫苗的制備 新鮮尿囊液0.5 mL（稀釋至106EID50）加入β-丙內酯，并使其充分混合，β-丙內酯最終濃度為0.1%（V/V），置4℃搖床上滅活12 h，37℃搖床上水解2 h。取滅活的尿囊液9.3 mL，逐滴加入0.7 mL Tween-80。然后在攪拌的同時，把尿囊液和吐溫的混合物逐漸加入20 mL白油佐劑中，充分乳化0.5 h，待尿囊液和白油充分包容后即為油乳劑滅活疫苗。

1.7 單因子血清的制備 對26日齡雛雞采血，取血清進行血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）試驗。將HI試驗為陰性的雛雞分成14組，分別用上述滅活疫苗肌肉接種4只26日齡雛雞，一免后2周進行二免，二免后1周翅靜脈采血測HI效價，HI效價達到8～10 1og2時，全部撲殺采集血清，4只雞的血清混合，60℃水浴10 min滅活。

1.8 交叉HI試驗 測定14株病毒的HA滴度，各重復4次，取其平均值，而后將其各配制成4個血凝單位。同一條件下用4個血凝單位的各病毒抗原分別測定上述準備的14種單因子血清對這14株H9N2 AIV株的HI效價，操作按GB/T 18936～2003進行。在微量反應板的1～11孔分別加入0.025 mLPBS，第12孔加入0.05 mL PBS。吸取0.025 mL血清加入第1孔內，充分混勻后吸0.025 mL于第2孔內，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025 mL棄去。1～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025 mL，室溫（約20℃）靜置至少30 min。每孔加入0.025 mL體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40 min（室溫約20℃），若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進行。對照紅細胞將呈顯紐扣狀沉于孔底。結果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度，最后比較抗原差異。

2 結果

2.1 HI交叉實驗 同一條件下用4個血凝單位的各病毒抗原分別測定上述準備的14種單因子血清對這14株H9N2 AIV株的HI效價，比較抗原差異。其HI滴度（數(shù)值應為取log2后的值）詳見表1。

表 1 14株H9N2禽流感病毒毒株 HI交叉試驗結果Table 1 Cross HI assay result of H9N2 Aviam infl uenza virus strains

2.2 抗原性結果分析 根據Guan等［7］研究，通過PRIMERversion 7.0 （PRIMER-E，Plymouth，United Kingdom）軟件分析HI滴度詳見圖1，其中R1～R14分別代表了上述14株H9N2 AIV。從檢測結果可以發(fā)現(xiàn)，A/Chicken/Shanghai /Y1 /2002和A/Chicken/Shanghai/ Y1/ 2006同屬于一個抗原群，A/Chicken/Shanghai /C/2011獨自成為一個抗原群，A/Pigeon/Shanghai/JC1/2013和A/Chicken/ Shanghai/1107/2013歸為同一個抗原群，其余毒株均為一個抗原群。整體來看，H9N2 AIV抗原發(fā)生了不同程度的漂變，但是在某個時間段，也會存在多種抗原群共存的情況。

圖1 14株H9N2亞型禽流感病毒抗原性聚類圖Fig. 1 Antigenic analysis of the fourteen H9N2 subtype Avian infl uenza virus strains

3 討論

本研究結果表明2002年和2006～2014年上海市分離的H9N2亞型禽流感病毒已發(fā)生了抗原漂移，14株H9N2亞型禽流感病毒的基因重組模式［8］可以分為5個不同的基因型，2002年和2006～2008年上海市分離的5株H9N2亞型禽流感毒株分別代表了4個不同的基因型：A/Chicken/Shanghai/Y1/2002、A/Chicken/ Shanghai/Y1/2006和A/Duck/Shanghai/C60/2007各單獨為一種基因型，A/Chicken/Shanghai/Y1/2007和A/ Chicken/Shanghai/Y2 /2008屬于一種基因型。2009年以后分離的9株H9N2 AIV屬于另一個基因型?；蛐秃涂乖杂幸欢ǖ南嚓P性，但是不明顯，可能還與HA基因上的主要抗原位點相關，這還需要進一步的分析。Guan等［9］對2000～2005年中國部分省分離的H9N2 AIV進行了抗原性分析，采用Qa/HK/ G1/97、Dk/HK/Y280/97和Ck/HK/G9/97相關的單抗進行分群。劉金華等［10］也進行了相關的研究，選擇1996～2008年分離的H9N2 AIV毒株，進行了交叉HI試驗，結果表明分離的毒株至少可以分成5個抗原群（A～E），他們認為這些抗原群和基因群存在一定的相關性，也和病毒的分離時間相關?？梢姡诠ぷ髦袘訌妼α鞲胁《颈O(jiān)測和研究，應該選擇與制苗毒株一致的毒株作監(jiān)測抗原，將與本地區(qū)流行的抗原性相近且免疫原性較好的毒株作為疫苗株，才能有效地控制流感的發(fā)生和流行。

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ANTIGENIC DRIFT OF H9N2 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VIRUS STRAINS ISOLATED FROM DIFFERENT YEARS

GE Fei-fei， LIU Jian， YANG De-quan， LI Xin， JU Hou-bin， ZHOU Jin-ping
（Shanghai Animal Disease Control Center， Shanghai 201103， China）

To analysis the antigenic characteristics of H9N2 subtype Avian infl uenza virus （AIV） isolated from Shanghai in 2002， 2006-2014， fourteen isolates were analysed by cross-hemagglutinin inhibition test （HI）. The results revealed that antigenic drift had occurred in H9N2 subtype AIV in Shanghai during 2002， 2006-2014. These strains could be classifi ed into four groups. A/chicken/Shanghai/Y1/2002 and A/chicken/ Shanghai/ Y1/2006 belonged to the same antigenic group. One strain A/chicken/Shanghai /C/2011 belonged to the other group. A/pigeon/Shanghai/JC1/2013 and A/ chicken/ Shanghai/1107/2013 belong to the other antigenic group. The remaining virus strains comprised one group. These results indicated that antigenic drift occurred in these years. A variety of antigenically distinct H9N2 AIVs cocirculated in Shanghai during the same period. The result provided scientifi c reference data for the prevention against H9N2 AIVs and the selection of vaccine strains.

H9N2 subtype AIV； cross-hemagglutinin inhibition test ； antigenic drift

S852.659.5

A

1674-6422（2015）05-0010-05

2015-05-05

上海市市級農口系統(tǒng)青年人才成長計劃（滬農青字（2014）第2-8號，滬農青字（2015）第2-3號）；滬農科攻字（2015）第1-11號

葛菲菲，女，博士，主要從事分子生物學檢測與病毒基因變異研究

周錦萍，E-mail：shzjpvet @163.com.