鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性與抗原性分析及細(xì)胞表位預(yù)測

陳文杰 杭柏林 劉保國 楊洋 劉莉莉 郭佳佳 寧春妹

摘要：為了解鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性、抗原性和細(xì)胞表位的特性，通過在線工具和軟件分析了鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。結(jié)果表明，鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33為分子質(zhì)量較大、帶正電荷、穩(wěn)定的微疏水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有較好的抗原性，有10條B細(xì)胞表位和14條T細(xì)胞表位，其中有4條重疊的多肽是B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位中的優(yōu)勢多肽，有5條交叉重疊的多肽是T細(xì)胞表位中的優(yōu)勢多肽。說明鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，優(yōu)勢表位多肽將為抗鴿毛滴蟲的表位疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴿毛滴蟲;黏附蛋白;抗原性;細(xì)胞表位;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S852.72 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0163-04

鴿毛滴蟲（Trichomonas gallinae）是一種可以感染鴿、雞等多種禽類的原蟲，引起鴿的疾病稱為鴿毛滴蟲?。═richomoniasis）或鴿癀[1-2]。鴿毛滴蟲病呈世界性分布，是鴿子的一種常見病[3]。因在鴿群中常常連綿不斷，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，鴿毛滴蟲病也被認(rèn)為是鴿子的一種重大疾病[4]。目前，主要通過藥物（中藥和西藥）和生物安全措施進(jìn)行鴿毛滴蟲病的治療和預(yù)防[5-7]。但是，鴿毛滴蟲的耐藥性蟲株逐漸出現(xiàn)[8]，同時(shí)某些西藥如甲硝唑因毒副作用被禁止用于動(dòng)物[9]。因此，必須尋找新的方法用來預(yù)防鴿毛滴蟲病。疫苗免疫是預(yù)防傳染病最好的方法。目前，還沒有用來預(yù)防鴿毛滴蟲病的商業(yè)性疫苗，但已有全蟲滅活疫苗和重組亞單位疫苗研究的報(bào)道[10-11]。羅鋒研究證實(shí)，以鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33制備的重組亞單位疫苗具有較好的免疫保護(hù)性[11]。

表位疫苗是利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科知識(shí)篩選抗原表位，構(gòu)建串聯(lián)表位基因，表達(dá)、純化后與某些免疫增強(qiáng)劑聯(lián)合使用的一種疫苗[12]，具有安全性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用生物信息學(xué)方法分析了鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞表位等特征，對(duì)深入研究鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的生物學(xué)功能具有重要意義，并為預(yù)防鴿毛滴蟲病候選疫苗的細(xì)胞表位篩選和表位疫苗研究提供候選靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33氨基酸序列來自文獻(xiàn)[11]，共有309個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為MLSSSFERNIHQPLLFIDKDTRVVIQGIGNQGQFHSRLMRQYGTKVVGAVHPKKSGTIIAGLPIFKDMKEVVKKTDANASLIFVPAPGAAQACIDAAKAGMGLVVCITEHIPQHDMIKVKKVMKETGCQLIGPNCPGLIQPGTHTKLGIIPTSIFANGKIGVVSRSGTLTYEAAFATTLAGLGQSTVVGIGGDPFAGQLHTDVVKRFAADPKTEGIILIGEIGGTSEEDAAEWIAKNQLCKEKPVVAFIAGATAPPGKRMGHAGAIVSGGKGTAEGKYKALEAAGVRIARHPGNMGKFIFEEMKRMGKI。

1.2 試驗(yàn)方法

用DNAStar軟件中的Protean工具分析蛋白的抗原性，用ProtParam工具 （https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白的理化特性，用npsa-prabi工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用T cell class I pMHC immunogenicity predictor工具（http：//tools.immuneepitope.org/immunogenicity/）分析蛋白的免疫反應(yīng)能力，用Antibody Epitope Prediction工具（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）分析蛋白的B細(xì)胞表位，用CD4 T cell immunogenicity prediction工具（http：//tools.immuneepitope.org/CD4episcore/）分析蛋白的CD4 T細(xì)胞表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性

通過ProtParam工具分析，可以得到蛋白的一些理化特性。經(jīng)過分析，鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33有309個(gè)氨基酸，由20種氨基酸構(gòu)成，分子式為 C1 447H2 356N404O413S15，有25個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]，有37個(gè)帶正電荷的氨基酸[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）];分子質(zhì)量為32 501.98 u，等電點(diǎn)（pI）為9.5;預(yù)測的半衰期：30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞，體外），>20 h（酵母，體內(nèi)），>10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）;不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為23.52，表明AP33蛋白為穩(wěn)定蛋白;脂肪性指數(shù)為89.39，GRAVY指數(shù)為0.031，表明AP33蛋白為微疏水性蛋白。

2.2 鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的二級(jí)結(jié)構(gòu)

通過SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION方法（構(gòu)象狀態(tài)為4，相似度閾值為8，視窗寬度為17）進(jìn)行分析，可以預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖1所示，AP33蛋白的氨基酸序列中有100個(gè)氨基酸參與了α螺旋，占比32.36%;66個(gè)氨基酸參與了延伸鏈，占比21.36%;36個(gè)氨基酸參與了β轉(zhuǎn)角，占比11.65%;107個(gè)氨基酸參與了隨機(jī)卷曲，占比34.63%。這表明鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33有著復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.3 抗原性分析

本研究對(duì)鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33進(jìn)行了理化特性、抗原性和細(xì)胞表位的初步分析，為深入研究鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的功能提供了參考依據(jù)，為鴿毛滴蟲表位疫苗的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Qiu S B，Lv M N，He X，et al. PCR identification and phylogenetic analysis of Trichomonas gallinae from domestic pigeons in Guangzhou，China[J]. The Korean Journal of Parasitology，2017，55（3）：333-336.

[2]趙保華，戴鼎震，楊一波. 鴿病防治圖譜[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2017：138-143.

[3]步衛(wèi)東. 乳鴿毛滴蟲與白色念珠菌共感染試驗(yàn)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（10）：98-99.

[4]羅 鋒，翁亞彪，張腱菲，等. 廣東省鴿毛滴蟲感染情況的調(diào)查[J]. 中國家禽，2006，28（17）：24-25.

[5]孫靜靜. 體外抗鴿源禽毛滴蟲中藥的篩選及其作用機(jī)理研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[6]陳文杰，杭柏林，楊 洋，等. 鴿毛滴蟲病預(yù)防與治療研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2020（2）：58-61.

[7]張秀玲. 鴿毛滴蟲病的發(fā)病機(jī)理及防治措施[J]. 中國家禽，2011，33（24）：64-65.

[8]羅 鋒，陳澤華，蘇遂琴，等. 鴿毛滴蟲病的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病，2007，15（3）：51-54.

[9]王延映. 高效液相色譜法測定飼料中甲硝唑、地美硝唑和異丙硝唑的方法研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[10]羅 鋒，李國清. 鴿毛滴蟲全蟲疫苗免疫效果研究[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治，2017（5）：5-7.

[11]羅 鋒. 鴿毛滴蟲的檢測與黏附蛋白基因工程疫苗的研究[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[12]趙 德，喬 翠，張 強(qiáng)，等. 表位疫苗研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（1）：102-106.

[13]崔治中，崔保安. 獸醫(yī)免疫學(xué)[M]. 2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：35，107，120.

[14]鄧安梅，仲人前，陳孫孝，等. 自身抗原SS-B/La序列結(jié)構(gòu)分析及抗原性預(yù)測[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2000，16（9）：471-473.

[15]杭柏林，李 杰，張慧輝，等. 雞抗菌肽NK-lysin的生物信息學(xué)分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（1上）：29-31，36，291-292.

[16]Sette A，Rappuoli R. Reverse vaccinology：developing vaccines in the era of genomics[J]. Immunity，2010，33（4）：530-541.

[17]姚翠梅，韓文愈，雷連成，等. CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測及其應(yīng)用[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì)、中國微生物學(xué)會(huì)獸醫(yī)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第三屆中國獸藥大會(huì)論文集. 2010：72-74.

[18]柳玉芳，龔 浪，林 瑩，等. 豬流行性腹瀉病毒表位疫苗的研制[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2019，35（4）：633-638.

[19]Cubillos C，de la Torre B G，Bárcena J，et al. Inclusion of a specific T cell epitope increases the protection conferred against foot-and-mouth disease virus in pigs by a linear peptide containing an immunodominant B cell site[J]. Virology Journal，2012，9：66.吳玲梅，溫智清，楊雪冰，等. 鄭州鯉養(yǎng)殖場鯉急性爛鰓病的癥狀與病原鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（24）：167-172.