利用Illumina MiSeq測序平臺分析沐川烏骨黑雞空腸微生物多樣性

廖娟 王鋼 喻世剛 梁梓

摘要：為探索沐川烏骨雞腸道微生物多樣性，采用Illumina MiSeq測序平臺對10羽沐川烏骨雞的空腸內(nèi)容物樣本中微生物的16S rDNA-V4變異區(qū)進(jìn)行測序，利用UPARSE等軟件分析和統(tǒng)計樣品中的操作分類單元（OTUs）數(shù)量，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構(gòu)成。結(jié)果表明，共獲得667 466條tags，在97%相似水平上進(jìn)行OTU分類，被歸類于3 154個OTUs，且由稀釋曲線可知此次測序結(jié)果較全面地覆蓋了沐川烏骨黑雞空腸微生物群落。門水平上，占優(yōu)勢的門主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），但這3種優(yōu)勢菌門在不同樣品中所占比例均有所差異。在屬水平上，在10個樣品中所占比例均大于1%的菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）和Romboutsia菌屬。

關(guān)鍵詞：沐川烏骨黑雞;Illumina MiSeq測序;空腸;微生物;多樣性

中圖分類號： S831;S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0178-04

在動物的身體部位中，胃腸道中定殖著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，這類復(fù)雜的微生物群落被稱為腸道微生物[1]。腸道微生物菌群在宿主營養(yǎng)、發(fā)育、免疫及代謝等過程中起著重要作用[2-3]。近年來，腸道微生物多樣性成為很多學(xué)者的研究熱點，腸道微生物多樣性的研究方法較多，早期主要采用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法[4]，但是腸道中有很多厭氧型細(xì)菌，傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法無法分離培養(yǎng)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，末端限制性片段長度多樣性分析、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳等技術(shù)廣泛運(yùn)用于腸道微生物的分析中，這些方法雖能檢測一些厭氧型微生物，但這些研究技術(shù)獲得的信息覆蓋量仍不能充分反映出腸道微生物的多樣性。Illumina MiSeq技術(shù)因其方便、快速、準(zhǔn)確率高和信息覆蓋量大等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于兔[5]、人[6]、蜜蜂[7]等的腸道微生物研究中。林奕岑等[8]、徐帥等[9]采用Illumina MiSeq技術(shù)分別對普通雞的盲腸和回腸的微生物多樣性進(jìn)行分析，但對沐川烏骨黑雞腸道微生物分析尚未見報道。沐川烏骨黑雞是四川省樂山市的優(yōu)良地方品種資源，在沐川縣具有悠久的種源歷史，屬藥肉兼用型品種，因其全身烏黑而得名[10]，其生產(chǎn)性能及健康程度與復(fù)雜的腸道微生物組成密切相關(guān)。本研究利用Illumina MiSeq測序平臺分析了沐川烏骨黑雞空腸微生物多樣性，旨在為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗采用1日齡健康的沐川烏骨黑母雞，購于四川省樂山市沐川縣黑鳳凰烏骨雞業(yè)有限公司，采用相同的飼養(yǎng)和管理方式。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 于30日齡時，隨機(jī)選取10羽健康個體，無菌操作采集每羽沐川烏骨黑雞的空腸內(nèi)容物，依次編號K1～K10，并快速置于液氮罐中，帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 總DNA提取 采用SDS方法提取空腸內(nèi)容物樣本基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，采用無菌水稀釋至1 ng/μL。

1.2.3 基因文庫構(gòu)建及上機(jī)測序 以稀釋后的樣品基因組 DNA 為模板，使用16S rRNA-V4區(qū)特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測后，切下目標(biāo)條帶，用Thermo Scientific 公司GeneJET膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

使用建庫試劑盒（Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒）進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量、檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。測序工作在諾禾致源生物信息有限公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

測序完成后，原始數(shù)據(jù)使用Cutadapt對低質(zhì)量部分進(jìn)行剪切[11]，再根據(jù)Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）后，利用UCHIME Algorithm 軟件去除嵌合序列[12]，得到有效數(shù)據(jù)（clean reads）。利用Uparse軟件對所有樣品的全部clean reads按97%的相似性進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）聚類。并對用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析[13-14]。采用Qiime軟件計算每個樣品的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品序列及OTUs信息

本試驗基于Illumina MiSeq測序平臺對10羽沐川烏骨黑雞的空腸內(nèi)容物菌群V4區(qū)進(jìn)行了測序，一共獲得667 466條tags，在97%的相似水平上進(jìn)行OTU分類，被歸類于3 154個OTUs。其中，tags數(shù)量最高的是樣品K3，為86 261條;tags數(shù)量最低的是樣品K9，為47 679條。

2.2 Alpha多樣性分析

采用Alpha多樣性指數(shù)分析樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。從樣品稀釋曲線（圖1）可知，隨著測試深度的不斷加深，稀釋曲線逐漸趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，10個樣本的覆蓋率（good's coverage）均達(dá)到了99.0%以上，表明更多的數(shù)據(jù)量僅會產(chǎn)生少量新OTUs，16S rRNA基因測序深度足以反映樣品的微生物多樣性。

采用Chao1、ACE、Shannon、Simpson等指數(shù)表示，樣品中微生物群落的Alpha多樣性。Chao1或ACE指數(shù)越大，表明樣品群落豐富度越高;Shannon指數(shù)越高，表明群落物種多樣性越高;Simpson指數(shù)越高，表示其群落均勻度越高。由表1可知，樣品K2物種豐富度相對較高，樣品K4物種多樣性相對較高。

3.3 物種注釋

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在門水平上最大豐度排名前10的物種和在屬水平上最大豐度排名前30的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在門和屬分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。由圖2和圖3可知，10個樣品共獲得45個菌門，559個菌屬。

門水平上，占優(yōu)勢的門主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），這3個菌門總比例在每個樣品中均在84%以上，但這3個優(yōu)勢菌門在不同樣品中所占比例有所差異。厚壁菌門在10個樣品中所占比例均最高，均高于35%，其中K7樣品中高達(dá)79%。

在屬水平上，共獲得559個菌屬，其中56個屬尚未被注釋出具體的菌屬名。在10個樣品中所占比例均大于1%的菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）和Romboutsia菌屬。不同菌屬在不同樣品中所占比例差異較大，其中，樣品K1和K6與其他樣品差異最為明顯。

3.4 聚類分析

為研究不同樣品間的相似性，基于Weighted Unifrac距離采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對樣品進(jìn)行聚類分析。由圖4可知，K1和K6這2個樣品的菌群與其他樣品組成差異較大。

3 討論

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法僅限于分離能在培養(yǎng)基上生長的微生物，而通過該方法鑒定的微生物僅占所研究樣品中所有微生物物種的1%～10%[15]。因此，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)分析所得到的結(jié)果并不能反映所研究樣品中微生物的多樣性。近年來，Illumina MiSeq測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種動物腸道微生物多樣性的研究，該技術(shù)可在短時間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)，而且檢測數(shù)據(jù)完整性好[16]。

本研究采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對沐川烏骨黑雞空腸微生物菌群進(jìn)行分析，樣品稀釋曲線分析表明，10個樣本的覆蓋率均達(dá)到99.0%，說明此次測序數(shù)據(jù)比較全面，能夠比較全面地反映10個研究對象的空腸微生物組成情況。但10羽沐川烏骨黑雞即使在相同的飼養(yǎng)和管理方式下，其空腸微生物的種類和數(shù)量也不完全相同，這可能與每個檢測

個體的宿主屬性（如身體情況、飲食習(xí)慣、自身激素水平等）有關(guān)[2]。

有關(guān)腸道微生物的研究均表明，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）為相對豐度最高的菌門[8-9，17]，本研究結(jié)果與之一致。Torok等進(jìn)行了肉雞飼喂試驗，結(jié)果表明厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門與肉雞生產(chǎn)性能相關(guān)[18]。厚壁菌門在健康的火雞[19]、肉雞[9]、蛋雞[17]的腸道中也是含量最多的菌群，厚壁菌門與粗飼料的消化吸收有關(guān)，對宿主體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝有重要作用。擬桿菌菌群發(fā)酵產(chǎn)物有醋酸鹽，可以刺激宿主黏液相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腸道黏液的產(chǎn)生[20]。

在物種注釋結(jié)果中屬水平上有56個屬尚未被注釋出具體的菌屬名，這表明有關(guān)雞腸道微生物在屬水平上的研究還不夠深入。腸道微生物是一個十分復(fù)雜的系統(tǒng)，即使同一批在相同的飼養(yǎng)和管理下的雞群，不同菌屬在不同個體腸道中所占比例差異也較大，每種菌屬在宿主的新陳代謝過程中均發(fā)揮著不同作用。隨著高通量測序的廣泛應(yīng)用，對腸道微生物的研究不斷深入，腸道微生物的功能研究將成為熱點，篩選出可提高宿主生產(chǎn)性能的有益微生物，對提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

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