光滑球擬酵母線粒體抵御乙偶姻脅迫的生理機制解析

李樹波，劉立明，2，陳 堅，2

（1.江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

光滑球擬酵母線粒體抵御乙偶姻脅迫的生理機制解析

李樹波1，劉立明1，2，陳 堅1，2

（1.江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

以光滑球擬酵母為出發(fā)菌株，利用生化和分子生物學實驗研究微生物抵御有機溶劑脅迫的生理機制。首先，添加檸檬酸鹽考察能量供給對細胞抵御乙偶姻脅迫的影響。與對照條件（0mmol/L檸檬酸鹽）相比，50mmol/L檸檬酸鹽可使細胞生物量在不同乙偶姻質(zhì)量濃度（6、10、12和15g/L）脅迫下分別提高了13.2%、14.2%、17.8%和25.2%。同時，通過表達線粒體融合分裂調(diào)控基因fzo1和dnm1，以細胞活力、胞內(nèi)活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）為研究指標考察調(diào)控線粒體融合分裂對乙偶姻脅迫的影響。結(jié)果表明：與對照菌株相比，在不同乙偶姻質(zhì)量濃度脅迫下（12和18g/L），增強線粒體融合可抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，使其水平分別降低了9.3%和16.2%；卻使胞內(nèi)ATP水平分別提高了9.7%和36.1%，從而延緩乙偶姻脅迫對細胞活力的影響，使細胞生物量相應(yīng)地提高了9.1%和29.7%。因此，通過添加檸檬酸或改善線粒體生理功能以提高胞內(nèi)能量供給，可有效提高微生物細胞抵御乙偶姻等環(huán)境脅迫的能力。

乙偶姻；活性氧；光滑球擬酵母；能力代謝；線粒體融合分裂

乙偶姻是一種羥基酮型有機溶劑，高濃度乙偶姻通過影響微生物細胞結(jié)構(gòu)來改變細胞生理功能和代謝能力［1］。目前，研究人員主要從生理功能、細胞結(jié)構(gòu)和生化組分等方面解析微生物抵御有機溶劑脅迫的生理機制：①通過改變細胞膜中不飽和脂肪酸的順-反異構(gòu)化、脂肪酸飽和度及磷脂極性頭部等結(jié)構(gòu)特性，增強細胞膜的堅固性并降低細胞膜的流動性，從而增強微生物對有機溶劑的適應(yīng)性［2-3］；②通過改變細胞壁組分構(gòu)成比例，增強對外界環(huán)境脅迫的抵抗能力［4］；③外排泵，可將胞內(nèi)與細胞結(jié)構(gòu)和生理功能不相關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運至胞外，以維持細胞正常生理功能［5］，如ATP結(jié)合盒超家族（ABC）外排泵、主要易化子超家族（MFS）、多重抗藥性家族（SMR）、多藥物和毒性化合物運輸?shù)鞍祝∕ATE）以及耐藥結(jié)節(jié)細胞分化（RND）家族［6-8］；④熱激蛋白等調(diào)控蛋白及其相應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)控蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運、折疊及降解等生理過程，提高微生物抵御外界環(huán)境（低酸、缺氧、高溫、饑餓和高鹽等）脅迫的能力［9-10］。此外，微生物還存在其他耐受機制，包括脫毒降解效應(yīng)［11-13］、能量代謝［11］以及合成海藻糖、甘油及氨基酸等相容性溶質(zhì)［14］。

然而，外排泵、細胞壁、細胞膜及脫毒反應(yīng)等保護機制的形成均是高耗能過程，且與胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)。而對于真核微生物，線粒體不僅是ATP主要合成場所，為細胞生理代謝活動提供能量和動力［15］，還參與維持胞內(nèi)Ca2+、Fe3+穩(wěn)定，物質(zhì)代謝及細胞凋亡等生理過程，在細胞抵御各種復(fù)雜環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用［16］。同時，作為不斷融合分裂的高度動態(tài)細胞器，高度動態(tài)線粒體比靜態(tài)線粒體更有利于實現(xiàn)微生物的生理功能。在酵母細胞中，動力蛋白相關(guān)GTP酶（Dnm1，the dynamin-related GTPase）和線粒體機動蛋白GTPase（Fzo1）調(diào)控著線粒體融合分裂過程，影響線粒體生理功能和形態(tài)［17-18］。其中，正常線粒體分裂過程可修復(fù)細胞氧化損傷，提高細胞對外界或內(nèi)部環(huán)境脅迫的能力［19］；而增強線粒體融合過程能促進線粒體間相互協(xié)同作用，有利于增強線粒體能量傳遞、信息溝通、DNA互補、膜電位傳遞及代謝物交換等生理過程［20-22］。因此，線粒體融合分裂過程在微生物細胞抵御外界環(huán)境脅迫中扮演著重要作用。目前，基于細胞凋亡角度研究有機溶劑對微生物細胞毒害作用的相關(guān)研究鮮見報道［23］。

因此，筆者將從線粒體融合分裂過程角度研究微生物細胞抵御有機溶劑脅迫的耐受機制，拓寬對微生物抵御有機溶劑脅迫生理機制的認識理解，為提高微生物抵御有機溶劑脅迫的能力提供新策略。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究中所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 培養(yǎng)基和緩沖液的配制

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，（NH4）2SO45，KH2PO45，MgSO40.8，乙酸鈉6。

發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖100g，尿素7g，KH2PO45g，MgSO40.8g，CaCO320g，乙酸鈉6g，微量元素液10mL。用于研究不同乙偶姻濃度對光滑球擬酵母生長的影響。

以上培養(yǎng)基中加維生素液10mL，調(diào)pH 5.5后115℃高壓滅菌15min。

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，g/L）：NaCl 8.0，KCl 0.2，KH2PO40.2，Na2HPO4·12H2O 2.9。

1.3 分析方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

挑取一環(huán)菌體接種于含有25mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃、200r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，以體積分數(shù)10%接種量接種于50mL含不同乙偶姻濃度發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，30℃、200r/min培養(yǎng)。

1.3.2 細胞生理特性的測定

當細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長初期（24 h），添加不同質(zhì)量濃度乙偶姻（0、6、12、15和18g/L）至發(fā)酵培養(yǎng)基中；30℃、200r/min培養(yǎng)36 h，分別取2mL發(fā)酵液用于測定不同乙偶姻濃度對光滑球擬酵母細胞生理特性的影響：①利用噻唑藍（MTT）法檢測不同乙偶姻脅迫條件下細胞活力的變化；②2，7-二氯雙乙酸鈉（DCFH-DA）在微生物胞內(nèi)通過酯化水解和氧化作用，可形成具有熒光特性的熒光物質(zhì)2，7-二氯DCF，通過測定胞內(nèi)DCF熒光強度計算胞內(nèi)活性氧（ROS）水平；③利用試劑盒測定胞內(nèi)ATP；③線粒體膜電位（ΔΨm）測定，羅丹明 123（rhodamine 123）能透過細胞膜作為線粒體跨膜電位指示劑，通過熒光信號強弱檢測線粒體膜電位和細胞凋亡情況的變化［24］。

1.4 工程菌株的構(gòu)建

根據(jù)S.cerevisiae中基因fzo1和dnm1序列，分別設(shè)計PCR引物Con-fzo-F/R和Con-dnm-F/R。下劃線序列分別為限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和XhoⅠ的識別位點（表2）。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃50 s，60℃ 50 s，72℃90 s，30個循環(huán)；72℃ 10min。利用質(zhì)量分數(shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產(chǎn)物，并使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化3 h，再利用T4 DNA連接酶將目的片段連接至質(zhì)粒pYX212；借助氨芐青霉素抗性和雙酶切方法篩選獲得陽性重組質(zhì)粒pYX212-fzo1和pYX212-dnm1。最后，將對照質(zhì)粒pYX212及重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至C.glabrata Δura3感受態(tài)中，并利用尿嘧啶缺陷型回復(fù)突變篩選獲得相應(yīng)重組菌株CON，C-Fzo1p和C-Dnm1p。

表2 本研究中所用引物Table 2 Primers used for PCR amplication in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 乙偶姻濃度對光滑球擬酵母生長的影響

為研究有機溶劑乙偶姻對C.glabrata細胞的毒害抑制作用，利用搖瓶培養(yǎng)，考察不同乙偶姻濃度對酵母細胞生長的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：低濃度乙偶姻脅迫對細胞毒害和正常生理功能影響較小。與對照組（0g/L）相比，低乙偶姻質(zhì)量濃度（6g/L）對細胞生長影響較小，其生物量僅降低了7.5%；但當乙偶姻質(zhì)量濃度提高至12g/L時，可有效地抑制細胞的生長，使其生物量降低了26.3%，僅為8.11g/L。

圖1 搖瓶培養(yǎng)測定不同乙偶姻質(zhì)量濃度對細胞生長的影響Fig.1 Effects of acetoin concentrations on cell growth（DCW）in liquid culture

2.2 檸檬酸對C.glabrata抵御乙偶姻脅迫的影響

檸檬酸可提高C.glabrata胞內(nèi)ATP供給，從而提高細胞抵御外界酸脅迫的能力［25］。因此，考察檸檬酸鹽（50mmol/L）對C.glabrata細胞抵御乙偶姻脅迫的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：與對照條件（0mmol/L檸檬酸鹽）相比，添加檸檬酸使細胞生物量分別提高了13.2%（6g/L乙偶姻）、14.2%（10g/L乙偶姻）、17.8%（12g/L乙偶姻）和25.2%（15g/L乙偶姻）。然而，當乙偶姻質(zhì)量濃度增加至18g/L時，檸檬酸鹽對細胞生長保護作用基本消失，使細胞生物量比對照組僅提高了4.2%。因此，提高胞內(nèi)ATP水平能有效提高細胞抵御高濃度乙偶姻脅迫的能力。但當外界環(huán)境脅迫超過一定閾值時，僅依賴能量代謝難以保護細胞抵御高濃度乙偶姻的脅迫。

圖2 檸檬酸鹽對細胞抵御乙偶姻脅迫的影響Fig.2 Effects of citrate on cell growth under different acetoin concentrations

2.3 過量表達fzo1和dnm1對C.glabrata抵御乙偶姻脅迫的影響

為研究線粒體融合分裂過程對細胞抵御乙偶姻脅迫的影響，利用平板點樣法和搖瓶培養(yǎng)，分別考察不同乙偶姻濃度對不同菌株生長的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3（a）可知：30℃培養(yǎng)72 h后，在低質(zhì)量濃度乙偶姻脅迫下（6和12g/L），不同菌株細胞生長情況相似；在15g/L乙偶姻條件下，不同菌株生長呈顯著差異，工程菌株C-Fzo1能正常生長，但菌株C-Dnm1和CON生長卻受到顯著的抑制作用；當乙偶姻質(zhì)量濃度增加至18或20g/L時，菌株CON和C-Dnm1的生長被完全抑制，而菌株C-Fzo1仍能正常生長，表現(xiàn)出良好的乙偶姻耐受性。這一結(jié)果表明，過量表達基因fzo1可顯著提高C.glabrata抵御乙偶姻脅迫的能力。圖3（b）證明：在對照條件（0g/L乙偶姻）下，菌株CON、C-Dnm1和C-Fzo1細胞生長情況差異較小，分別為10.16、10.01和10.25g/L。當乙偶姻質(zhì)量濃度增加至12和18g/L時，與對照菌株CON細胞生物量（7.71和3.23g/L）相比，菌株C-Fzo1的細胞生物量分別為8.41g/L和4.19g/L，分別提高了9.1%和29.7%；而菌株C-Dnm1的細胞生物量卻分別降低至6.59和3.01g/L。這一結(jié)果再次證明：增強線粒體融合過程更有利于 C.glabrata抵御高濃度乙偶姻的脅迫。

圖3 乙偶姻濃度對不同菌株生長的影響Fig.3 Effects of acetoin concentration on cell growth in different engineered strains

2.4 過量表達fzo1和dnm1對C.glabrata生理特性的影響

2.4.1 乙偶姻濃度對不同菌株細胞活力的影響

采用MTT法，以吸光度表征乙偶姻對細胞活力的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：隨著乙偶姻濃度的增加，菌株CON、C-Dnm1和C-Fzo1細胞活力均逐漸降低，但其下降比例差異較大。與對照條件（0g/L）相比，15g/L乙偶姻使對照菌株CON細胞活力降低了43.4%；而菌株C-Dnm1細胞活力降低比例最大，為45.7%；然而，菌株C-Fzo1細胞活力僅降低了31.3%。同時，當乙偶姻質(zhì)量濃度提高至18g/L或20g/L時，菌株C-Fzo1細胞活力進一步降低（比對照條件分別減少了 44.5%和47.6%），而菌株CON和C-Dnm1細胞活力并沒有持續(xù)減少，但卻維持在較低水平（約為0.3）。因此，C.glabrata對乙偶姻脅迫的最高耐受質(zhì)量濃度可能為15g/L，而過量表達基因fzo1能有效延緩或削弱高濃度乙偶姻對細胞活力的影響，提高細胞抵御乙偶姻脅迫的能力。

圖4 乙偶姻質(zhì)量濃度對不同菌株細胞活力的影響Fig.4 Effects of acetoin concentration on the cell proliferation in different strains by MTT analysis

2.4.2 乙偶姻濃度對不同菌株胞內(nèi)ROS、ATP水平的影響

研究乙偶姻對不同菌株胞內(nèi)ROS和ATP水平變化的影響，為進一步解析乙偶姻對細胞的毒害機制提供實驗支持，結(jié)果如圖5所示。與對照條件（0g/L乙偶姻）相比，12g/L和18g/L乙偶姻使菌株CON胞內(nèi)ROS水平分別提高了17%和44%。但與對照菌株CON相比，菌株C-Dnm1胞內(nèi)ROS水平卻分別提高了10.2%（12g/L）和13.4%（18g/L）；菌株C-Fzo1能有效消除抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，使胞內(nèi)ROS水平分別降低了9.3%（12g/L）和16.2%（18g/L）。同時，通過對不同菌株胞內(nèi)ATP水平的測定分析發(fā)現(xiàn)：與對照菌株CON相比，高濃度乙偶姻脅迫使菌株C-Dnm1胞內(nèi)ATP水平分別降低了13.2%（12g/L）和20%（18g/L）；而菌株C-Fzo1胞內(nèi)ATP水平卻分別提高了9.7%（12g/L）和36.1%（18g/L）。

綜上所述，高濃度乙偶姻可改變胞內(nèi)ROS和ATP水平，而胞內(nèi)低水平ATP可導(dǎo)致胞內(nèi)各代謝反應(yīng)供能不足，從而影響細胞正常的生理活動，促進胞內(nèi)ROS水平的提高，可能是降低C.glabrata抵御乙偶姻脅迫能力的關(guān)鍵因素。然而，增強線粒體融合過程可提高胞內(nèi)ATP的合成能力，延緩胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，為細胞正常生理活動提供更多能量供給和適宜的胞內(nèi)微環(huán)境，提高細胞應(yīng)對高濃度乙偶姻脅迫的能力。

圖5 乙偶姻濃度對不同菌株生理特性的影響Fig.5 Effects of acetoin concentrations on the levels of cellular ROS and ATP production in different strains

3 結(jié)論

以有機溶劑乙偶姻為例研究微生物抵御有機溶劑脅迫的生理機制，并為提高微生物抵御有機溶劑脅迫能力提供新的方法策略。通過外源添加檸檬酸鹽實驗發(fā)現(xiàn)，增加微生物胞內(nèi)ATP供給可更有利于提高微生物細胞抵御高濃度乙偶姻脅迫的能力。而作為酵母細胞中重要的亞細胞器，線粒體可參與能力代謝、細胞凋亡等多種生理功能。通過過量表達線粒體融合分裂關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，調(diào)控線粒體的融合分裂過程，改變微生物細胞抵御外界環(huán)境脅迫的能力。研究結(jié)果表明，與對照菌株CON相比，增強線粒體融合過程可有效延緩高濃度乙偶姻脅迫對細胞活力的影響；抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，使胞內(nèi)ROS水平分別降低了9.3%（12g/L）和16.2%（18g/L），但卻使胞內(nèi)ATP水平分別提高了9.7%（12g/L）和36.1%（18g/L），有效提高了光滑球擬酵母抵御高濃度乙偶姻脅迫的能力。因此，從線粒體角度解析微生物抵御有機溶劑脅迫的生理機制，不僅拓寬對有機溶劑耐受機制的認識和理解，也為增強微生物細胞抵御外界環(huán)境脅迫提供新的策略。

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（責任編輯 管 珺）

Physiological mechanism of mitochondrion against acetoin stress in Candida glabrata

LI Shubo1，LIU Liming1，2，CHEN Jian1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To elucidate the tolerant mechanism of Candida glabrata against acetoin stress，we studied its physiological and biochemical characteristics through two strategies.First，50mmol/L of citrate was added to increase intercellular energy production under different concentrations of acetoin（6，10，12 and 15g/L），and cell growth increased by 13.2%，14.2%，17.8%and 25.2%，respectively，compared to the control condition（without addition of citrate）.Furthermore，the genes of fzo1 and dnm1 were also over-expressed to regulate mitochondrial function，and some important parameters（the intracellular reactive oxygen species（ROS）and adenosine triphosphate（ATP））were analyzed.Compared to the control strain，improving mitochondrial fusion （over-expressing fzo1） could effectively decrease intercellular ROS production with 9.3%and 16.2%，respectively，under 12g/L and 18g/L of acetoin. Moreover，it could significantly increase intracellular ATP generation with 9.7%and 36.1%，and DCW 9.1%and 29.7%，respectively.Based on the above results，increasing intercellular energy levelsthrough adding some citrate and improving mitochondrial fusion function was favorable to enhance the cellular robustness for acetoin stress.

acetoin；reactive oxygen species；Candida glabrata；energy metabolic；mitochondrial fusion-fission

TQ224.22

A

1672-3678（2015）03-0001-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.001

2014-04-18

國家自然科學基金重點項目（20836003）；全國優(yōu)秀博士學位論文作者專項基金（200962）

李樹波（1985—），男，廣西桂林人，博士，研究方向：微生物食品制造；陳 堅（聯(lián)系人），教授，E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn