反相高效液相色譜法測定石榴皮多酚類物質(zhì)方法的建立及分析

蒲 博，張馳翔，王 周，唐鵬程，焦士蓉

（西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

反相高效液相色譜法測定石榴皮多酚類物質(zhì)方法的建立及分析

蒲 博，張馳翔，王 周，唐鵬程，焦士蓉

（西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

建立了同時測定石榴皮多酚中綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素含量的反相高效液相色譜方法。采用色譜柱Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm），其流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（體積比17∶83），流速為1.0mL/min，檢測波長310nm，柱溫為30℃。建立安石榴甙測量方法，色譜柱為Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-2%冰醋酸（體積比7∶93）；體積流量為1.0mL/min；檢測波長為232nm；柱溫25℃。結(jié)果表明：綠原酸、表兒茶素、鞣花酸、槲皮素和安石榴甙在一定濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其平均回收率分別為100.66%（RSD=2.06%）、100.05%（RSD=0.58%）、100.05%（RSD=0.51%）、99.51%（RSD=1.22%）和99.79%（RSD=0.52%）。此結(jié)果說明反相高效液相色譜可用于測定石榴皮多酚類物質(zhì)。

石榴皮多酚；色譜柱；RP-HPLC

石榴皮為石榴干燥果皮，其性酸、味澀。石榴皮中含有綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素及安石榴甙等多酚類化合物，具有抗癌、抗氧化等生物活性［1-4］。對于石榴皮成分的高效液相測定法，大多都是針對其鞣花酸含量的測定，另外對其兒茶素和表兒茶素的測定也較多，對于石榴皮中安石榴甙、槲皮素、綠原酸測定的文獻較少［5-11］。

本實驗中，筆者建立同時測定石榴皮多酚中綠原酸、表兒茶素、鞣花酸、槲皮素的反相高效液相色譜方法（RP-HPLC），并建立安石榴甙的 RPHPLC的測定方法和參數(shù)，以期為石榴皮藥材的質(zhì)量評價、控制及其規(guī)范化種植研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴皮，成都中藥飲品有限公司；乙腈、甲醇（色譜純），F(xiàn)isher公司；鞣花酸、槲皮素、綠原酸、表兒茶素、安石榴甙，Sigma公司。

LC20高效液相色譜系統(tǒng)、配SPD-M20A型二級管陣列檢測器、CTO-20A型柱溫箱和SIL-20AC型自動進樣器，島津（SHIMADZU）公司；水相、有機相0.45μm微孔濾膜、0.45μm微孔濾頭，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 波長的選擇

通過全波譜掃描，對綠原酸、表兒茶素、鞣花酸、槲皮素和安石榴甙的檢測波長進行選擇［12-13］。

1.2.2 色譜條件

綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素混標(biāo)色譜條件［14-15］：色譜柱為 Hypersil ODS2（250nm×4.6nm，5μm，大連依利特公司）；流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（體積比17∶83）；流速為1.0mL/min；檢測波長310nm；柱溫為30℃；理論塔板數(shù)按鞣花酸計大于8 000；鞣花酸（保留時間為8.681min）、槲皮素（保留時間為17.238min）、綠原酸（保留時間為4.392min）、表兒茶素（保留時間為5.463min）的分離度大于1.5。

安石榴甙色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm，大連依利特公司）；流動相為甲醇-2%冰醋酸溶液（體積比7∶93）；體積流量為1.0mL/min；檢測波長為232nm；柱溫25℃；理論塔板數(shù)按安石榴甙計大于8 000；分離度大于1.5。

1.2.3 對照品溶液的準(zhǔn)備

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的對照品鞣花酸5mg、槲皮素5mg、綠原酸2mg、表兒茶素5mg和安石榴甙5mg，用50%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇溶解至50mL，將配好的溶液超聲脫氣20min，冷卻至室溫，搖勻，過濾，濾液即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待用。

1.2.4 供試品溶液的制備

石榴皮經(jīng)干燥、粉碎過180μm篩，以多酚為考察指標(biāo)提取條件：溫度75℃、料液比1∶30g/mL、提取時間140 s，經(jīng)水提取得到的提取物多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.06%，濃縮、凍干，精密稱取凍干粉500mg，用50%的甲醇定容至50mL，用于綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素的測量。稱取凍干粉50mg，用50%的甲醇定容至50mL，用于安石榴甙的測量。將配好的溶液都超聲脫氣20min，將其冷卻至室溫，振蕩搖勻，過濾，濾液即為供試品溶液，待用。

1.2.5 純化品試樣的制備

將石榴皮提取物經(jīng)D101型大孔樹脂純化，濃縮、凍干，得到石榴皮純化物。用福林酚比色法測得其中多酚含量為71.63%。按照方法1.2.3制備純化品溶液，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長的選擇

通過全波譜掃描發(fā)現(xiàn)，在310nm波長下，綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素均有較強吸收峰，且無干擾物質(zhì)出現(xiàn)，因此選用在310nm波長下檢測綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素。而安石榴甙在232nm波長下有最大吸收度，故選用232nm作為安石榴甙的檢測波長。

2.2 色譜分析結(jié)果

綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素的對照品及樣品色譜圖見圖1。

安石榴甙的對照品及樣品色譜圖見圖2。

2.3 線性關(guān)系考察

取鞣花酸、槲皮素、表兒茶素和安石榴甙對照品4個梯度溶液25、50、75和100 μg/mL；取綠原酸對照品4個梯度溶液10、20、30和40 μg/mL。在上述色譜條件下分別對每個標(biāo)準(zhǔn)品的每個濃度進樣20 μL，測定其峰面積。以進樣濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各自的回歸方程。鞣花酸：Y=1.5×106X-5.3×105（R2= 0.999 4）；綠原酸：Y=7.4×107X-1.2×105（R2= 0.999 3）；槲皮素 Y=1.6×108X-7.5×105（R2= 0.999 4）；表兒茶素Y=2.1×105X-6.9×104（R2= 0.999 5）；安石榴甙Y=3.9×105X-2.9×105，（R2= 0.999 5）。

圖1 綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)品與供試品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of chlorogenic acid，epicatechin，ellagic acid and quercetin in standard solution and sample solution

圖2 安石榴甙的標(biāo)準(zhǔn)品與供試品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of pomegranate glycoside in standard solution and sample solution

2.4 精密度試驗

精密吸取綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素混合對照品溶液20 μL以及安石榴甙對照品20 μL，重復(fù)進樣5次，測定其峰面積。它們峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為 0.68%、0.72%、0.38%、0.80%和1.50%（n均為5）。結(jié)果表明儀器精密度較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

分別將綠原酸、表兒茶素、鞣花酸、槲皮素混合供試液和安石榴甙供試液于0、2、6、8和10 h各進樣20 μL，測定其峰面積，它們峰面積RSD值分別為1.12%、0.75%、0.20%、0.74%和 0.49%（n均為5）。結(jié)果表明供試液在常溫下10 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性試驗

按照供試溶液制備的方法，對同一批樣品，分別取樣平行測定5次，進樣20 μL，測定其峰面積。它們峰面積RSD值分別為1.14%、1.90%、0.35%、1.04%和1.01%（n均為5）。該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收試驗

精密稱取已測含量未純化（綠原酸0.41%、表兒茶素0.30%、鞣花酸6.23%、槲皮素0.61%和安石榴甙28.73%）的石榴皮提取物凍干粉若干，加入適當(dāng)?shù)膶φ掌?，按上述方法制?份樣品溶液，進樣20 μL，分別進行回收率測定（n=5），結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果Table 4 recovery test results

2.8 石榴皮純化品中多酚物質(zhì)的含量測定

采取上面綠原酸、表兒茶素、鞣花酸和槲皮素混標(biāo)及安石榴甙單標(biāo)的色譜方法對石榴皮純化品中多酚物質(zhì)的含量進行測定，進樣量為20 μL，結(jié)果見表5。由表5可知，純化后石榴皮提取物中多酚物質(zhì)的含量都得到了提高。

表5 純化前與純化后多酚物質(zhì)含量Table 5 content before purification and purified polyphenols

3 結(jié)論

通過實驗得到石榴皮提取液凍干粉的鞣花酸含量為6.23%；槲皮素的含量為0.61%；綠原酸的含量為0.41%；表兒茶素含量為0.30%；安石榴甙含量為28.73%。通過精密性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗等，表明按本實驗方法檢測石榴皮中綠原酸、表兒茶素、鞣花酸、槲皮素和安石榴甙比較簡便和可靠。最后對石榴皮提取物純化品中多酚物質(zhì)進行了RP-HPLC法測量，測得結(jié)果為鞣花酸含量9.44%，綠原酸含量0.53%，槲皮素含量0.75%，表兒茶素含量0.32%，安石榴甙含量46.91%。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Determination of polyphenols in pomegranate peel by reverse-phase HPLC

PU Bo，ZHANG Chixiang，WANG Zhou，TANG Pengcheng，JIAO Shirong
（School of Food and Science and Biotechnology，Xihua University，Chengdu 610039，China）

We established reverse-phase HPLC to separate and determine the contents of chlorogenic acid，epicatechin，ellagic acid and quercetin in pomegranate peel polyphenol.The chromatographic conditions were as follows：Hyspersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）at 30℃ with UV detector at 310nm，mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid（17∶83），and flow rate 1.0mL/min. Simultaneously，We established a method to measure the content of pomegranate glycosides.The chromatographic conditions were as follows：Hyspersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5μm）at 25℃ with UV detector at 232nm，mobile phase of methanol-0.4%glacial acetic acid（7∶93），and flow rate 1.0mL/min.Chlorofenic acid，epicatechin，ellagic acid，quercetin and pomegranate glycosides showed a good linear relationship with peak area in an appropriate concentration range，and the average recoveries were 100.66%（RSD=2.06%），100.05%（RSD=0.58%），100.05%（RSD=0.51%），99.51%（RSD= 1.22%）and 99.79%（RSD=0.52%），respectively.Our findings prove that the reverse-phase HPLC developed is suitable to determine polyphenols from pomegrunate.

pomegranate peel polyphenols；chromatographic column；RP-HPLC

O657.72

A

1672-3678（2015）03-0055-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.010

2014-04-16

教育部春暉計劃（12205543）；四川省教育廳自然科學(xué)重點項目（09ZA158）；西華大學(xué)省級重點實驗室開放研究基金

蒲 博（1989—），男，四川巴中人，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)；焦士蓉（聯(lián)系人），教授，E-mail：jsrong2004@163.com