惡臭假單胞菌腈水合酶βAla97影響催化己二腈的區(qū)域選擇性

張 君，崔文璟，劉 義，崔幼恬，周哲敏

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

惡臭假單胞菌腈水合酶βAla97影響催化己二腈的區(qū)域選擇性

張 君，崔文璟，劉 義，崔幼恬，周哲敏

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

對惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）腈水合酶（PpNHase）催化己二腈進行研究，發(fā)現(xiàn)PpNHase只能催化己二腈中1個氰基生成單酰胺產(chǎn)物5-氰基戊酰胺，具有區(qū)域選擇性；睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）腈水合酶（CtNHase）能催化己二腈直接生成己二酰二胺，不具有催化區(qū)域選擇性。為了闡明這一區(qū)域選擇性差異的機制，對CtNHase和PpNHase β亞基的氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示同源性為94.1%，CtNHase存在βAla97缺失。基于此分析，構(gòu)建了PpNHase β97位Ala的缺失突變體（ΔAla97）。利用高效液相色譜檢測ΔAla97催化己二腈的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)ΔAla97能將底物完全催化為己二酰二胺，表明βAla97是影響催化己二腈由5-氰基戊酰胺向己二酰二胺轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵氨基酸。

腈水合酶；己二腈；生物催化；區(qū)域選擇性

腈水合酶（EC 4.2.1.84，nitrile hydratase，NHase），是一種用來催化腈類物質(zhì)生成酰胺類物質(zhì)的金屬酶［1］，在自然界中分布廣泛，大多產(chǎn)腈水合酶的微生物為革蘭氏陽性菌屬，如諾卡氏菌屬（Nocardia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、假棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、短桿菌屬（Brevibacterium）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）等。腈水合酶根據(jù)活性中心所需輔因子的不同，一般可以分為鈷型腈水合酶［2］（Co-NHase）和鐵型腈水合酶［3］（Fe-NHase）。惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）來源的NHase為鈷型腈水合酶，成熟酶由2個α亞基和2個β亞基構(gòu)成［4］，一般以α2β2四聚體形式存在，α亞基和β亞基的相對分子質(zhì)量分別為2.3×104和2.41×104［5］，其活性中心Co2+的攝取依賴編碼β、α亞基基因（ba）下游p基因的翻譯產(chǎn)物P亞基，通過自身交換機制來完成［2］。腈水合酶在工業(yè)上主要用來生產(chǎn)煙酰胺［6］及丙烯酰胺［7］，與化學(xué)催化相比，利用腈水合酶進行生物轉(zhuǎn)化有高選擇性、無副產(chǎn)物、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快及環(huán)境污染較小等諸多優(yōu)勢［8-12］。

腈水合酶根據(jù)催化底物類型的不同，還可以分為芳香型腈水合酶（包括雜環(huán)型）和脂肪型腈水合酶兩類［4］。現(xiàn)有研究僅發(fā)現(xiàn)腈水合酶能催化己二腈以及多聚物如聚丙烯腈［13-16］，而對其催化過程和機制尚不明確。Moreau等［17］研究發(fā)現(xiàn)腈水合酶催化己二腈可生成中間產(chǎn)物5-氰基戊酰胺和終產(chǎn)物己二酰二胺，具有催化的區(qū)域選擇性。與此不同，Comamonas testosteroni腈水合酶能將底物己二腈全部轉(zhuǎn)化為己二酰二胺，不生成中間產(chǎn)物5-氰基戊酰胺。5-氰基戊酰胺是一種農(nóng)藥中間體，可以用來生產(chǎn)三唑啉酮類除草劑［18］，也可以作生產(chǎn)己內(nèi)酰胺和堿性紅29的前體。終產(chǎn)物己二酰二胺，是重要的精細化工原料、醫(yī)藥中間體，價格較昂貴。因此，闡明腈水合酶催化己二腈的區(qū)域選擇性機制對利用酶法制備5-氰基戊酰胺和己二酰二胺具有重要意義。

本研究中，筆者在P.putida來源的NHase催化己二腈具有區(qū)域選擇性的基礎(chǔ)上，通過序列比對、缺失突變鑒定影響P.putida腈水合酶催化己二腈區(qū)域選擇性的熱點氨基酸。此研究結(jié)果將對進一步闡明腈水合酶對己二腈的區(qū)域選擇性機制、提高底物轉(zhuǎn)化率及利用腈水合酶催化制備己二酰二胺具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

含有Pseudomonas.putida NRRL-18668來源的NHase（PpNHase）的重組質(zhì)粒pET24a-bap、Escherichia coli JM109和BL21（DE3）保藏于筆者所在實驗室。

2YT固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨16，酵母提取物10，NaCl 5，瓊脂粉20；pH 7.0。

1.1.2 試劑與儀器

Primer STARTMHS DNA Polymerase、DpnⅠ，TaKaRa公司；己二腈、己二酰二胺，Sigma公司；5-氰基戊酰胺，天津科技大學(xué)王敏教授惠贈。引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。質(zhì)粒DNA小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NHase的表達和純化

將編碼P.putida腈水合酶（PpNHase）及P亞基基因的重組質(zhì)粒pET24a-bap轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，接種至含有50 μg/mL（終質(zhì)量濃度）卡那霉素的10mL 2YT培養(yǎng)基中，200r/min、37℃過夜培養(yǎng)。再將活化的重組菌BL21（DE3）按1∶100的體積比接種到100mL新鮮的2YT培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)至600nm吸光度值（OD600）0.6～0.8，加入終濃度為0.6mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以及終質(zhì)量濃度為0.1mg/L的 Co2+，200r/min、28℃下誘導(dǎo)16 h。

1）酶分離、純化過程 收集菌體，用20mmol/L Tris-HCl緩沖液洗清洗3次，超聲破碎后收集上清液，進行（NH4）2SO4分級沉淀，范圍為40%～75%，將最終得到的蛋白液在4℃透析12 h。

3）凝膠過濾層析 將濃縮后的酶蛋白液注入預(yù)先用緩沖液（20mmol/L Tris-HCl pH 7.4）平衡的Superdex 200 10/300GL層析柱中，用分離緩沖液（20mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.15mol/L NaCl）進行洗脫，并收集目的蛋白，即為純化得到的純酶，SDS-PAGE檢測純化結(jié)果。純化的蛋白置于-20℃保存，用于測定酶的區(qū)域選擇性。

1.2.2 催化產(chǎn)物的檢測

反應(yīng)體系：將20 μL 300 μg/mL純酶加入到430 μL 20mmol/L Tris-HCl緩沖液中，再加入50 μL 200mmol/L底物己二腈，30℃反應(yīng)10min，加入500 μL甲醇終止反應(yīng)。產(chǎn)物測量參考Moreau等［17］報道的測量方法，并稍作改進。使用Diamonsil 5μm×250 mm×4.6 mm C18色譜柱分離5-氰基戊酰胺和己二酰二胺。流動相采用25mmol/L H3PO4和色譜純甲醇（體積比89.01∶10.09，pH 2.5），柱溫為30℃，流速1.0mL/min，紫外檢測波長為200nm。

1.2.3 突變株的構(gòu)建

以pET24a-bap為模板，將β鏈97位Ala進行缺失，構(gòu)建出缺失突變體ΔAla97，用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase試劑盒進行全質(zhì)粒擴增（PCR），擴增引物見表1。PCR條件：95℃5min，98℃20 s，57℃30 s，68℃6.5min，18個循環(huán)；68℃5min終止程序。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，再用DNA純化試劑盒切膠回收7 kb左右的pET24a-bap及突變后的重組質(zhì)粒，經(jīng)過DpnⅠ酶37℃將模板消化1 h后，轉(zhuǎn)化JM109，挑取單菌落過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，驗證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進行表達。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 腈水合酶表達、純化

收集過夜誘導(dǎo)的重組菌BL21（DE3）/pET24abap，經(jīng)過破碎，離心、（NH4）2SO4沉淀、離子層析凝膠過濾等進行分離得到較純的腈水合酶，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見：在2.4×104處有較純的目的蛋白條帶（α亞基相對分子質(zhì)量2.34×104，β亞基相對分子質(zhì)量2.4×104），表明經(jīng)過此分離純化方法得到了較純的NHase，通過測定純化前后酶的比活力，得出純化倍數(shù)為11.6倍。

圖1 NHase純化過程的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified NHase

2.2 野生型NHase催化底物區(qū)域選擇性的檢測

首先利用高效液相色譜（HPLC）分別檢測10mmol/L的己二酰二胺和5-氰基戊酰標準樣品，然后檢測用純化的惡臭假單胞菌NHase（PpNHase）催化己二腈生成的產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示。由圖2（a）和圖2（b）可知：己二酰二胺標準樣品保留時間為3.32min，5-氰基戊酰胺標準樣品保留時間為5.27min。由圖2（c）可知：反應(yīng)時間分別為10和30min時，產(chǎn)物為5-氰基戊酰胺，沒有己二酰二胺生成；反應(yīng)時間為80min時，產(chǎn)物中沒有明顯的己二酰二胺生成，絕大部分為中間產(chǎn)物5-氰基戊酰胺；繼續(xù)延長反應(yīng)時間，不能增加己二酰二胺的生成量。本結(jié)果說明PpNHase對己二腈具有催化的區(qū)域選擇性，僅能催化己二腈生成5-氰基戊酰，不能繼續(xù)催化5-氰基戊酰生成二酰二胺。

2.3 基因序列比對結(jié)果

C.testosteroni5-MGAM-4D來源的NHase能催化己二腈生成己二酰二胺，具有區(qū)域選擇性［19］。而NHase的β亞基與底物的選擇、結(jié)合有密切的關(guān)系。將C.testosteroni來源的NHase（CtNHase，GenBank：AY743666）和PpNHase（GenBank：U89363.1）蛋白質(zhì)一級序列進行BLAST比對，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：CtNHase與PpNHase氨基酸序列的相似度為94.1%。一個明顯的區(qū)別是，相對于PpNHase，CtNHase缺失了βAla97，有缺失突變。βAla97可能與己二腈催化的區(qū)域選擇性有關(guān)。

圖2 樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectra of samples

圖3 惡臭假單胞菌和睪丸酮叢毛單胞菌來源的腈水合酶β鏈氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of the β chain of NHase from P.putida and C.testosteroni

2.4 缺失突變體的構(gòu)建及表達

基于以上分析，筆者構(gòu)建了 βAla97缺失的PpNHase和ΔAla97。以含有PpNHase（基因結(jié)構(gòu)為bap）的重組質(zhì)粒pET24a-bap作為模板，按“1.2.3”方法進行全質(zhì)粒PCR，構(gòu)建突變體，基因測序表明成功構(gòu)建了突變體。

將重組質(zhì)粒pET24a-bap/ΔAla97轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），挑取單菌落，誘導(dǎo)表達 ΔAla97。按“1.2.1”方法純化，獲取突變體純酶ΔAla97。SDSPAGE分析純化結(jié)果如圖 4所示。由圖 4可見：PpNHase的β亞基缺失97位Ala后，其NHase的α、 β亞基相對分子質(zhì)量都為2.3×104左右，可以看到NHase實現(xiàn)了表達，并且得到了較純的蛋白。

2.5 PpNHase中Ala97缺失突變體區(qū)域選擇性變化

利用HPLC檢測突變體ΔAla97催化己二腈區(qū)域選擇性的變化，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：突變體ΔAla97純酶與己二腈分別反應(yīng)10、60和80min時，催化產(chǎn)物中均有明顯的己二酰二胺生成，并且己二酰二胺的生成量隨反應(yīng)時間延長而增加。反應(yīng)80min時，底物己二腈完全被催化為己二酰二胺，無5-氰基戊酰胺保留，說明βAla97缺失顯著改變了PpNHase催化己二腈的區(qū)域選擇性，βAla97是影響NHase催化己二腈區(qū)域選擇性的熱點氨基酸。

圖4 突變體的純化蛋白SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of the purified mutant NHase

圖5 突變體的NHase催化己二腈不同時間下產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.5 HPLC spectra of the product of mutant PpNHase catalyzing adiponitrile at different reaction time

腈水合酶的區(qū)域選擇性與酶分子自身和底物均有關(guān)。李建軍等［20］分析了Rhodococcus sp.AJ270腈水合酶催化二腈的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該催化的區(qū)域選擇性會受底物結(jié)構(gòu)的影響。首先，底物二腈分子的柔順性和2個氰基的空間伸展方向，能決定該底物分子能否被酶所水解，當分子結(jié)構(gòu)具有剛性的順式共平面時，對酶催化有抑制作用。其次，底物分子中2個氰基的距離和構(gòu)型影響酶催化的區(qū)域選擇性，剛性的順式共平面不利于選擇性地水解二腈分子中的單個氰基。本研究中選用的己二腈，在空間結(jié)構(gòu)上不是上述剛性平面結(jié)構(gòu)，而是具有較好的柔順性，適宜用來作為研究不同來源的腈水合酶對二腈催化的區(qū)域選擇性的底物。目前有報道的NHase催化己二腈區(qū)域選擇性的3種菌株，分別是Rhodococcus ruber CGMCC3090［21］、 P.chlororaphis B23［6］和C.testosteroni 5-MGAM-4D［19］，其中前2種菌株的NHase能夠區(qū)域選擇地催化己二腈，主要生成5-氰基戊酰胺。與本研究所用的P.putida NRRL-18668 NHase催化性質(zhì)相似，而C.testosteroni NHase與己二腈反應(yīng)生成的終產(chǎn)物全部為己二酰二胺。通過比對4個不同區(qū)域選擇性的腈合酶氨基酸序列，α鏈的相似性為31.3%，β鏈的相似性為58.43%，其中P.putida NRRL-18668 NHase與 C.testosteroni NHase相似度極高，卻有著不同的區(qū)域選擇性。P.putida NRRL-18668 NHase β鏈的97位丙氨酸殘基位于β鏈上的不規(guī)則區(qū)域，在具有相同區(qū)域選擇性菌株中沒有一定的規(guī)律。

3 結(jié)論

通過缺失β鏈的97位丙氨酸，改變了腈水合酶催化己二腈的區(qū)域選擇性，原始酶僅能將己二腈轉(zhuǎn)化為5-氰基戊酰胺，而變異體可以將己二腈轉(zhuǎn)化為己二酰二胺。變異體在反應(yīng)過程中有5-氰基戊酰胺積累，隨著時間的推移，5-氰基戊酰胺逐步減少，說明此過程是分兩步進行的，己二腈分子的1個氰基首先被催化，之后另外1個氰基被催化。推測此氨基酸殘基的缺失可以使中間產(chǎn)物5-氰基戊酰胺易于結(jié)合活性中心，最終促進其轉(zhuǎn)化為己二酰二胺。

綜上，筆者利用基因序列比對，采用定點突變的方法，發(fā)現(xiàn)了決定腈水合酶催化己二腈反應(yīng)生成己二酰二胺為終產(chǎn)物的區(qū)域選擇性的關(guān)鍵氨基酸位點，為β鏈上97位的Ala。本研究初步闡明了P.putida來源的腈水合酶對己二腈的區(qū)域選擇性機制，提高了底物轉(zhuǎn)化率，對利用腈水合酶催化制備己二酰二胺具有重要的指導(dǎo)意義。

［1］Mahadevan S，Thimann K V.Nitrilase：II.substrate specificity and possible mode of action［J］.Arch Biochem Biophys，1964，107：62-68.

［2］Zhou Z，Hashimoto Y，Shiraki K，et al.Discovery of posttranslational maturation by self-subunit swapping［J］.Proc Nat Aca Sci USA，2008，105（39）：14849-14854.

［3］Mascharak P K.The active site of nitrile hydratase：an assembly of unusual coordination features by nature［J］.Mol Design Inorg Biochem，2013，85：89-113.

［4］Liu Y，Cui W，Xia Y，et al.Self-subunit swapping occurs in another gene type of cobalt nitrile hydratase［J］.PloS One，2012，7（11）：e50829.

［5］Brodkin H R，Novak W R P，Milne A C，et al.Evidence of the participation of remote residues in the catalytic activity of co-type nitrile hydratase from Pseudomonas putida［J］.Biochemistry，2011，50（22）：4923-4935.

［6］Nishiyama M，Horinouchi S，Kobayashi M，et al.Cloning and characterization of genes responsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomonas chlororaphis B23［J］.J Bacteriol，1991，173（8）：2465-2472.

［7］Martinez S，Kuhn M L，Russell J T，et al.Acrylamide production using encapsulated nitrile hydratase from Pseudonocardia thermophila in a sol-gel matrix［J］.J Mol Catal B：Enzymatic，2014，100：19-24.

［8］Banerjee A，Sharma R，Banerjee U C.The nitrile-degrading enzymes：current status and future prospects［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60（1/2）：33-44.

［9］Kobayashi M，Shimizu S.Nitrile hydrolases［J］.Curr Opin Chem Biol，2000，4（1）：95-102.

［10］Martinkova L，Mylerova V.Synthetic applications of nitrileconverting enzymes［J］.Curr Org Chem，2003，7：1279-1295.

［11］Singh R，Sharma R，Tewari N，et al.Nitrilase and its application as a"green"catalyst［J］.Chem Biodivers，2006，3：1279-1287.

［12］Wang M X.Enantioselective biotransformations of nitriles in organic synthesis［J］.Top Catal，2005，35（1/2）：117-130.

［13］Babu V，Choudhury B.Competitive adsorptions of nitrile hydratase and amidase on polyacrylonitrile and its effect on surface modification［J］.Colloid Surf B，2012，89：277-282.

［14］Battistel E，Morra M，Marinetti M.Enzymatic surface modification of acrylonitrile fibers［J］.Appl Surf Sci，2001，177（1/2）：32-41.

［15］Fischer-Colbrie G，Matama T，Heumann S，etal.Surface hydrolysis of polyacrylonitrile with nitrile hydrolysing enzymes from Micrococcus luteus BST20［J］.J Biotechnol，2007，129（1）：62-68.

［16］Tauber M M，Cavaco-Paulo A，Robra K H，et al.Nitrile hydratase and amidase from Rhodococcus rhodochrous hydrolyze acrylic fibers and granular polyacrylonitriles［J］.Appl Environ Microb，2000，66（4）：1634-1638.

［17］Moreau J L，Azza S，Bigey F，et al.Application of highperformance liquid-chromatography to the study of the biological transformation of adiponitrile［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1994，656（1）：197-202.

［18］Shapiro R，Dicosimo R，Hennessey S M，et al.Discovery and development of a commercial synthesis of azafenidin［J］.Org Process Res Dev，2001，5（6）：593-598.

［19］Petrillo K L，Wu S J，Hann E C，et al.Over-expression in Escherichia coli of a thermally stable and regio-selective nitrile hydratase from Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D［J］.Appl Microbiol Biotech，2005，67（5）：664-670.

［20］李建軍，李紀生，王梅祥.二腈的區(qū)域和對映選擇性生物水解反應(yīng)：腈水合酶與二腈分子作用模式初探［J］.化學(xué)學(xué)報，2001，59（10）：1827-1830.

［21］Wang S，Dai Y，Wang J，et al.Molecular insights into substrate specificity of Rhodococcus ruber CGMCC3090 by gene cloning and homology modeling［J］.Enzyme Microb Tech，2013，52（2）：111-117.

（責(zé)任編輯 管 珺）

βAla97 of nitrile hydratase from Pseudomonas putida affects regioselectivity towards adiponitrile

ZHANG Jun，CUI Wenjing，LIU Yi，CUI Youtian，ZHOU Zhemin
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Nitrile hydratase（NHase）from Pseudomonas putida（PpNHase）to catalyzes adiponitrile（a kind of dinitriles）only to 5-cyanopentanamide（monoamide），indicating that only one of the cyano group was catalyzed to amide whereas the others not.This finding demonstrates that PpNHase exhibits catalyzing regioselectivity.On the other hand，NHase derived from Comamonas testosterone（CtNHase）catalyzes adiponitrile directely to adipamide（diamide），without catalyzing regioselectivity towards adiponitrile.In order to illustrate the mechanism of regioselectivity of PpNHase towards adiponitrile，alignment of protein sequence of β subunit between PpNHase and CtNHase was compared.Though they shows high homology（94.1%），the β subunit of PpNHase has an additional 97 alanine compared to that of the CtNHase.Therefore，a mutant PpNHase with deletion of Ala97（ΔAla97） was constructed.Highperformance liquid chromatography（HPLC） analysis showed that the mutant ΔAla97 converted adiponitrile to adipamide completely，indicating that Ala97 locating at the β-subunit is the pivotal aminoacid influencing conversion of 5-cyanopentanamide to adipamide.Those results will be helpful to elucidatethe regioselective mechanism.

nitrile hydratase；adiponitrile：biocatalysis；regioselectivity

Q814；Q78

A

1672-3678（2015）03-0041-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.008

2014-02-16

國家自然科學(xué)基金（31070711）

張 君（1989—），女，湖南益陽人，碩士研究生，研究方向：酶工程；周哲敏（聯(lián)系人），教授，E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn