正交試驗(yàn)優(yōu)選通竅活血膠囊水提工藝

雷曉翠　安紅偉　頓玲露　趙世亮　徐榛　王少洲

【摘要】目的：優(yōu)選通竅活血膠囊的最佳提取工藝。方法：以芍藥苷含量和干膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)通竅活血膠囊提取工藝的影響，采用HPLC法測(cè)定芍藥苷的含量。結(jié)果：最佳提取工藝為加12倍量水提取3次，每次30min；芍藥苷含量為21.10mg/g，干膏率為23.42%。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，為通竅活血膠囊的合理開發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】通竅活血膠囊；正交試驗(yàn)；芍藥苷

【中圖分類號(hào)】R284.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2015）20-0006-03

OptimizationofExtractionTechnologyforTongqiaohuoxueCapsulebyOrthogonalTest

LeiXiaocui1AnHongwei1*DunLinglu1ZhaoShiliang2XuZhen2WangShaozhou2

1.LiuzhoutraditionalChineseMedicalHospital，GuangxiLiuzhou545001，China；

2.GuangxiUniversityofChineseMedicine，GuangxiNanning530001，China

Abstract：ObjectiveTooptimizetheextractiontechnologyforTongqiaohuoxueCapsule.MethodTheextractionconditionswereoptimizedbyorthogonaltest，withthesolventvolume，extractiontimeandextractiontimesastheinfluencingfactors，thecontentofthePaeoniflorinandtheyieldofdryextractwereusedastheevaluationindexes.ThecontentofpaeoniflorinwasdetectedbyHPLCmethod.ResultTheoptimalextractionconditionswere：refluxingextractionfor3timesand30mineachtimewith12foldamountofwater.Thecontentofthepaeoniflorinwas21.10mg/gandtheyieldofdryextractwas23.42%.ConclusionTheextractiontechnologyisreasonable，reliable，andprovidesafoundationforthefurtherproductionandqualitycontrolofTongqiaohuoxueCapsule.

Keywords：TongqiaohuoxueCapsule；Orthogonaltest；paeoniflorin

通竅活血膠囊是由赤芍、川芎、桃仁、紅花、紅棗、鮮姜、老蔥、麝香等多味中藥組成的制劑，具有活血化瘀，通竅活絡(luò)的作用。藥理研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血膠囊可以改善腦組織的病理學(xué)損傷、保護(hù)腦組織抗氧化酶的活性、減輕氧自由基對(duì)腦組織的損傷[1]，并減輕微循環(huán)障礙[2]。為了合理制定通竅活血頰囊的提取工藝，研究根據(jù)處方中藥物有效成分的理化性質(zhì)和藥理作用，結(jié)合中醫(yī)臨床用藥的特點(diǎn)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)通竅活血膠囊的提取工藝進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1儀器與試藥

1.1儀器LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司）；MS204-S電子天平（梅特勒-托利多）；VP-1400H型真空泵（東莞市普立真空設(shè)備有限公司）；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；YZ-180DB型超聲波清洗儀（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；S.HH.W21.600S型數(shù)顯式三用電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2試劑與試藥芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201438，中國藥品生物制品檢定所）；赤芍芍等飲片購于國藥控股廣西中藥飲片有限公司。乙腈（批號(hào)：141175，美國Fisher）、甲醇（批號(hào)：140400，美國Fisher）為色譜純；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)本方臨床以湯劑形式應(yīng)用，且方中藥材主要有效成分多為皂苷和多糖類成分，均有較好的水溶性，所以本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮法提取。以處方中赤芍所含的有效成分芍藥苷的含量及干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并按以上兩指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為80%和20%進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分[3]。采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）進(jìn)行優(yōu)選。因素水平見表1。

表1正交試驗(yàn)因素水平表

2.2干膏得率測(cè)定精密吸取正交試驗(yàn)濃縮液10ml，置于已恒重的干燥蒸發(fā)皿中水浴蒸干后，置于105℃烘箱中干燥至恒重，迅速置于干燥器放冷，稱重，計(jì)算得膏率。

2.3芍藥苷含量測(cè)定

2.3.1色譜條件DiamonsilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（14：86）[4]；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：l0μl。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，分離度應(yīng)不低于1.5[5]。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取在芍藥苷對(duì)照品3.10mg，置10ml容量瓶中，加適量甲醇溶解，再加甲醇至刻度制成濃度為0.31mg/ml的對(duì)照品溶液，搖勻，備用。

2.3.3供試品溶液的制備按處方量精密稱取處方中各味中藥（麝香、黃酒除外），按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，提取，過濾，合并濾液，濃縮至1∶1，精密吸取濃縮液1ml置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加適量甲醇溶解過濾至25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。

2.3.4陰性對(duì)照液的制備制備缺白芍藥材的提取液，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.5線性關(guān)系考察分別取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml置于10ml溶量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取上述各對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=36472X-91686（R2=0.9948，n=6）。表明芍藥苷在6.20～37.1μg范圍呈良好線性關(guān)系。

2.3.6陰性樣品干擾考察精密吸取陰性對(duì)照溶液10μl注入液相色譜儀，發(fā)現(xiàn)在與芍藥苷對(duì)照品出峰的相應(yīng)位置上，陰性供試品無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說明樣品中的其他成分不干擾芍藥苷的測(cè)定。圖譜見圖1。

2.3.7含量測(cè)定分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液與“2.3.3”項(xiàng)下的供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定芍藥苷的含量。對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照?qǐng)D譜見圖1。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2、表3。

表2水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

注：綜合評(píng)分=（得膏率/最大得膏率）×100×0.2+（芍藥苷含量/最大芍藥苷含量）×100×0.8

表3方差分析結(jié)果

由表2、表3可知：影響提取效果的因素大小順序?yàn)椋篊>A>B，即提取次數(shù)>加水量>提取時(shí)間，加水量（A）和提取次數(shù)（C）有顯著影響，且C3>C2>C1，A3>A2>A1，B2>B3>B1。由于提取時(shí)間對(duì)結(jié)果沒有顯著性影響，故選擇提取時(shí)間為30min，最佳工藝為A3B1C3，即加12倍量水提取3次每次30min。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可靠性，分別取3份按處方比例混合的藥材，按照優(yōu)選的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，優(yōu)選的提取工藝切實(shí)可行。見表4。

表4水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3討論

3.1指標(biāo)參數(shù)的確定通竅活血膠囊含有多味中藥，成分較為復(fù)雜，故選擇干膏率作為考察指標(biāo)之一。芍藥苷為方中赤芍的主要活性物質(zhì)之一，是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)藥。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能通過減少腦組織自由基的產(chǎn)生、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抑制內(nèi)源性神經(jīng)肽內(nèi)皮素的產(chǎn)生，從而對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[6]；通過提高機(jī)體消除自由基能力和增加Nrf2表達(dá)來減輕局灶性腦缺血再灌注損傷后自由基引起的氧化損傷作用，從而對(duì)缺血性腦組織起到腦保護(hù)作用[7]，故選擇芍藥苷作為另一考察指標(biāo)。

3.2評(píng)分方法試驗(yàn)設(shè)定了芍藥苷含量和干膏率兩個(gè)考察指標(biāo)，故采用綜合加權(quán)評(píng)分法，可以兼顧各項(xiàng)指標(biāo)，以各試驗(yàn)綜合得分評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，可化多指標(biāo)為單指標(biāo)進(jìn)行分析，簡(jiǎn)單方便。

3.3指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的確定多指標(biāo)成分綜合評(píng)價(jià)優(yōu)選中藥提取工藝，應(yīng)該結(jié)合各指標(biāo)成分對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響來確定指標(biāo)成分在綜合加權(quán)評(píng)分法中的權(quán)重系數(shù)。根據(jù)試驗(yàn)的目的，處方中指標(biāo)性成分芍藥苷的含量對(duì)提工藝的影響更重要，故評(píng)分時(shí)設(shè)定干膏率和芍藥苷含量的權(quán)重分別占綜合評(píng)分的20%和80%，以優(yōu)選出更具科學(xué)性和合理性的提取工藝[8]。

3.4HPLC流動(dòng)相的確定實(shí)驗(yàn)在選擇流動(dòng)相時(shí)，參照《中國藥典》赤芍項(xiàng)下的芍藥苷含量測(cè)定方法，經(jīng)過數(shù)次的試驗(yàn)，其中包括改變流動(dòng)相組成：分別嘗試以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液，甲醇-0.05%磷酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；改變流動(dòng)相比例：對(duì)乙腈-0.1%磷酸溶液的比例18：82、17：83、16：84、15：85、14：86、13：87進(jìn)行比較，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）為最佳洗脫條件，此時(shí)的峰形較好，分離度大于0.5，理論塔板數(shù)大于3000。所以實(shí)驗(yàn)選取乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）為流動(dòng)相。

3.5提取工藝的確定通過對(duì)干膏率和芍藥苷含量綜合加權(quán)評(píng)分的分析，確定其最佳提取工藝為以12倍量水提取3次，每次30min。并以此工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，兩項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)性好（RSD%<2%），表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、提取簡(jiǎn)便、易于操作，符合生產(chǎn)的要求。參考文獻(xiàn)

[1]汪寧，劉青云，彭代銀，等.通竅活血湯對(duì)腦缺血大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（5）：407-409.

[2]葛金文，陳大舜，朱惠斌，等.王清任三逐瘀湯對(duì)心肌缺血家兔凝血及纖溶功能的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2000，7（1）：22-24.

[3]李霞，梁惠珍，門九章.正交試驗(yàn)優(yōu)選雄芍顆粒的水提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（5）：40-41.

[4]楊慈海，范常龍.高效液相色譜法測(cè)定斑禿丸中芍藥苷的含量[J].海峽藥學(xué)，2014，26（3）：45-46.

[5]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：147.

[6]李冬梅，徐麗，張淑珍，等.芍藥苷對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27（11）：1139-1142.

[7]何錦悅，饒夢(mèng)琳，唐蜜，等.芍藥苷對(duì)局灶性大鼠腦缺血再灌注腦組織中SOD、Nrf2表達(dá)的影響及神經(jīng)保護(hù)作用[J].2014，38（2）：178-182.

[8]蔡軍.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選退黃口服液提取工藝[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（26）：128-130.

（收稿日期：2015.07.06）