四川茶樹(shù)品種資源中EGCG3″Me研究

李建華，齊桂年，陳盛相，朱明珠

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安625014；2.四川省茶葉產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，四川名山625100）

四川茶樹(shù)品種資源中EGCG3″Me研究

李建華1，2，齊桂年1，*，陳盛相1，朱明珠1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安625014；2.四川省茶葉產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，四川名山625100）

采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)四川70份茶樹(shù)品種資源新梢中（-）-表沒(méi)食子兒茶素-3-O（3-O-甲基）沒(méi)食子酸酯（EGCG3″Me）含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3份茶樹(shù)品種資源富含EGCG3″Me（含量＞10 mg/g），即蜀茶5號(hào)、金觀音、城西11號(hào)。對(duì)蜀茶5號(hào)新梢季節(jié)及葉位變化規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)春、夏、秋三季，隨著新梢葉片成熟，EGCG3″Me含量均先增加后降低；同等葉位相比，EGCG3″Me含量均呈遞增趨勢(shì)；含量最高的葉位為秋梢第二葉，秋梢第一葉至第四葉均超過(guò)10 mg/g。以蜀茶5號(hào)秋梢加工成4種茶類，發(fā)現(xiàn)綠茶、黃茶中EGCG3″Me含量最高，與鮮葉相當(dāng)，其次為青茶，而紅茶中未檢出，且萎凋顯著增加其含量。建議四川富含EGCG3″Me茶葉將秋梢一芽二、三葉加工成綠茶或黃茶，且在加工前進(jìn)行適度攤放（輕度萎凋）。

EGCG3″Me，茶樹(shù)品種資源，季節(jié)，葉位，加工

（-）-表沒(méi)食子兒茶素-3-O-甲基-沒(méi)食子酸酯（EGCG3″Me）是一種天然存在于茶葉中的O-甲基化兒茶素，并被證明比EGCG具有更強(qiáng)的抗過(guò)敏作用［1-2］。國(guó)內(nèi)研究主要集中在茶葉中EGCG3″Me的分離、純化及檢測(cè)分析［3-4］，但對(duì)富含EGCG3″Me茶樹(shù)品種資源篩選的報(bào)道很少。而關(guān)于茶樹(shù)品種資源新梢中EGCG3″Me含量與生長(zhǎng)季節(jié)關(guān)系的研究?jī)H局限于夏季或春夏［5-7］，未對(duì)其含量在不同葉位的變化規(guī)律進(jìn)行研究；同時(shí)，茶樹(shù)品種資源新梢中EGCG3″Me保留量與其加工工藝關(guān)系雖已在綠茶、普洱茶、白茶、烏龍茶、紅茶有少量報(bào)道［7-9］，但在黃茶加工上未有人研究。四川為我國(guó)古老茶區(qū)之一，不僅擁有豐富的茶樹(shù)品種資源，而且主產(chǎn)多種茶類［10-12］。但未見(jiàn)關(guān)于四川高EGCG3″Me茶樹(shù)品種資源的篩選研究。

基于上述客觀事實(shí)，本研究首先采用HPLC法對(duì)四川70份茶樹(shù)品種資源秋梢中EGCG3″Me含量進(jìn)行測(cè)定，篩選出富含EGCG3″Me（＞10 mg/g）的茶樹(shù)品種資源，系統(tǒng)研究不同季節(jié)、不同葉位中EGCG3″Me含量的變化規(guī)律，從而確定富含EGCG3″Me茶葉的采摘標(biāo)準(zhǔn)；在此基礎(chǔ)上分別制成綠茶、黃茶、烏龍茶和紅茶，研究EGCG3″Me在加工過(guò)程中的變化規(guī)律，以期為富含EGCG3″Me茶樹(shù)品種資源的篩選、高EGCG3″Me茶葉的制備，以及進(jìn)一步在食品和制藥領(lǐng)域開(kāi)發(fā)和利用天然的EGCG3″Me奠定研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

70份茶樹(shù)品種資源分別種植于四川省名山良種場(chǎng)茶樹(shù)品種園、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)品種園和四川夾江天福茶樹(shù)品種園；沒(méi)食子酸、咖啡堿、C、EC、EGC、EGCG、ECG標(biāo)液Sigma公司；EGCG3″Me標(biāo)液由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

3000高壓高效液相色譜儀，包括DGP-3600SD泵，WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3000柱溫箱和DAD-3000檢測(cè)器，AcclaimTM120（5 μm，120 ?，4.6 mm×250 mm）C18色譜柱，通過(guò)Chromeleon?7色譜工作站控制并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理美國(guó)Dionex UltiMate；FDU-2200冷凍干燥機(jī)日本東京理化公司；Velocity 18R離心機(jī)日本島津；Arium Comfort純水機(jī)德國(guó)賽多利斯股份公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備70份茶樹(shù)品種資源一芽二葉秋梢，采摘后液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室，蒸汽殺青，90℃烘干，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

不同季節(jié)（春、夏、秋）新梢，采摘后收集其不同葉位（芽、第一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、莖），液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室，蒸汽殺青，90℃烘干，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

富含EGCG3″Me茶樹(shù)品種資源的秋梢一芽二、三葉按照相應(yīng)加工工藝制成綠茶、黃茶、青茶和紅茶［13］。綠茶加工主要工序?yàn)闅⑶?、揉捻、干燥；黃茶加工主要工序?yàn)闅⑶?、揉捻、悶黃、干燥；青茶加工主要工序?yàn)槲颉⒆銮?、殺青、揉捻、干燥；紅茶加工主要工序?yàn)槲?、揉捻、發(fā)酵、干燥。取各工序樣，液氮保存，-80℃冷凍干燥，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品提取準(zhǔn)確稱取1.2.1干燥的樣品粉末150 mg，加入50%乙腈（V/V）25 mL、30℃、120 r/min黑暗下浸提40 min，之后8000 r/min 4℃離心15 min，上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用［14］。

1.2.3兒茶素分析方法采用HPCL方法對(duì)EGCG3″Me等兒茶素進(jìn)行分析。色譜條件如下：

流動(dòng)相為KH2PO4緩沖液（0.02 mol/L，pH2.5）-乙腈溶液；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25℃［14］。

梯度洗脫程序：8%的B相起始，0～5 min保持8%的B相不變，5～25 min B相從8%線性增加到11%，25～ 50 min B相從11%線性增加到21%，50～51 min B相增加至95%，51～54 min保持B相95%不變，54～55 min B相從95%降至8%，56～60 min保持B相8%。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定結(jié)果均以平均值±SD（n=3）表示，作圖采用Origin 7.0，方差分析采用ANOVA。

2　結(jié)果與分析

2.1四川茶樹(shù)品種資源EGCG3″Me含量測(cè)定

四川茶樹(shù)品種資源EGCG3″Me含量見(jiàn)表1及部分色譜圖見(jiàn)圖1。從表1可知，不同茶樹(shù)品種資源EGCG3″Me含量差異大，范圍在0～11.04 mg/g之間，但其含量遠(yuǎn)低于茶葉中主要的四種兒茶素EC、EGC、EGCG、ECG，C含量較低。30份茶樹(shù)品種資源中含有EGCG3″Me，占總調(diào)查資源數(shù)的42.86%，其中僅有3份茶樹(shù)品種資源（蜀茶5號(hào)、金觀音、城西11號(hào)）中EGCG3″Me含量超過(guò)10 mg/g；此外，在8～10 mg/g之間的茶樹(shù)品種資源也僅有3份，為肉桂、川農(nóng)2號(hào)、蒙山11號(hào)；含量在6～8 mg/g的茶樹(shù)品種資源有1份，為鐵觀音；5份含量在4～6 mg/g左右的茶樹(shù)品種資源，分別為浙農(nóng)117、蒙山29號(hào)、錫茶5號(hào)、黃葉早、霞浦元宵茶；18份含量在0～4 mg/g的茶樹(shù)品種資源，分別為英紅1號(hào)、越南大葉、英紅2號(hào)、安溪水仙、四季春、金萱、翠玉、梅占、黃葉水仙、黃金桂、八仙茶、福建水仙、福選9號(hào)、福選4號(hào)、龍井長(zhǎng)葉、青峰、連南大葉茶、蜀永906。

圖1　茶樹(shù)品種資源蜀茶5號(hào)HPLC色譜圖Fig.1　Elution profiles of tea lines Shucha5

2.2茶樹(shù)新梢EGCG3″Me含量季節(jié)及葉位變化規(guī)律

為了進(jìn)一步弄清茶樹(shù)新梢EGCG3″Me含量季節(jié)及葉位變化規(guī)律，采摘茶樹(shù)品種資源蜀茶5號(hào)的春、夏、秋三季的新梢一芽五葉進(jìn)行研究。第二葉位色譜圖見(jiàn)圖2，EGCG3″Me季節(jié)及葉位變化規(guī)律見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，在春、夏、秋三季中，隨著茶樹(shù)新梢葉片的成熟，從芽、第一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉到莖，EGCG3″Me含量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。其中，春、夏、秋三季中，含量最高的葉位分別為春梢第四葉、夏梢第二葉、秋梢第二葉，含量分別為7.93、10.92、14.58 mg/g，它們均顯著高于同季節(jié)茶樹(shù)新梢的其他葉位（p＜0.05）；而含量最低的葉位均為春梢、夏梢、秋梢的莖，含量分別為0.32、1.05、1.06 mg/g，均顯著低于同季節(jié)茶樹(shù)新梢的其他葉位（p＜0.01）。

續(xù)表

圖2　茶樹(shù)品種資源蜀茶5號(hào)秋梢第2葉HPLC色譜圖Fig.2　Elution profiles of tea lines Shucha 5 at the second leaf in autumn

圖3　蜀茶5號(hào)新梢EGCG3"Me含量季節(jié)及葉位變化圖Fig.3　Relationship of leaf order，seasons and contents of EGCG3"Me of tea shoots in Shucha 5

同等葉位相比，EGCG3″Me含量均呈遞增趨勢(shì)，如秋梢第二葉中EGCG3″Me含量（14.58 mg/g）是夏梢第二葉含量（10.92 mg/g）的1.34倍，是春梢含量（6.72 mg/g）的2.17倍。富含EGCG3″Me（含量＞10 mg/g）的葉位分別是夏季第二葉、秋季第一葉至第四葉，含量最高的新梢葉位分別為秋季第二葉和第三葉，含量分別為14.58、12.02 mg/g；其次是夏季第二葉、秋季第四葉、秋季第一葉，含量為10.92、10.39、10.02 mg/g。統(tǒng)計(jì)分析表明，它們均顯著高于同季節(jié)茶樹(shù)新梢的其他葉位（p＜0.05）。因此，為了獲得富含EGCG3″Me（含量＞10 mg/g）茶葉，蜀茶5號(hào)采摘季節(jié)和采摘標(biāo)準(zhǔn)以秋梢一芽二、三葉為佳。

2.3茶葉加工過(guò)程中EGCG3″Me含量變化規(guī)律

為進(jìn)一步弄清茶葉加工過(guò)程中EGCG3″Me含量變化規(guī)律，采摘蜀茶5號(hào)的秋梢一芽二、三葉作為鮮葉，分別制成的綠茶、黃茶、青茶、紅茶，各茶類加工主要工序中EGCG3″Me含量變化見(jiàn)圖4?？梢钥闯?，在各茶類干燥工序后，EGCG3″Me含量在綠茶中含量最高，為10.37 mg/g，其次是黃茶、青茶，分別為10.17、9.34 mg/g，紅茶中未檢測(cè)到。其中，鮮葉（10.47 mg/g）加工成綠茶、黃茶后，EGCG3″Me含量變化差異不顯著（p＞0.05）。

在綠茶加工過(guò)程中，殺青顯著降低了鮮葉中EGCG3″Me含量（p＜0.01），但揉捻顯著增加了殺青葉中EGCG3″Me含量（p＜0.01），干燥使殺青葉中EGCG3″Me含量顯著降低（p＜0.01）。但總體來(lái)說(shuō)，加工而成的綠茶與鮮葉EGCG3″Me含量差異不顯著。在黃茶加工過(guò)程中，殺青同樣顯著降低了EGCG3″Me含量（p＜0.01），揉捻顯著增加殺青葉EGCG3″Me含量（p＜0.01），但悶黃和揉捻葉中EGCG3″Me含量差異不顯著，干燥使悶黃葉EGCG3″Me含量顯著降低（p＜0.05），黃茶與綠茶加工過(guò)程中EGCG3″Me含量變化規(guī)律大體一致，含量同樣與鮮葉相當(dāng)。

在青茶加工過(guò)程中，萎凋工序顯著增加了鮮葉中EGCG3″Me含量（p＜0.01），之后的做青、殺青中含量差異不顯著，但均顯著降低了萎凋葉中EGCG3″Me含量（p＜0.01），揉捻使殺青葉中的EGCG3″Me含量顯著增加（p＜0.05），但之后的干燥工序使揉捻葉顯著降低（p＜0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，青茶顯著降低了鮮葉中EGCG3″Me含量（p＜0.05）。在紅茶加工過(guò)程中，萎凋同樣顯著增加了鮮葉中EGCG3″Me含量（p＜0.01），但之后的揉捻、發(fā)酵和干燥使其急劇降低，尤其是發(fā)酵和干燥工序后，其含量均未檢測(cè)到。

圖4　茶葉加工過(guò)程中EGCG3"Me含量變化圖Fig.4　Changes in contents of EGCG3"Me during tea processing

3　討論

Sajio于1982年從茶樹(shù)品種“Benihomare”鮮葉中分離出EGCG3″Me［15］。之后Chiu和Lin也發(fā)現(xiàn)“Chinshin”中也含有EGCG3″Me［9］。本研究也從四川70份茶樹(shù)品種資源發(fā)現(xiàn)含有EGCG3″Me，并且篩選出富含EGCG3″Me的資源，發(fā)現(xiàn)其EGCG3″Me的春梢、夏梢和秋梢中含量最高的葉位分別為第四葉、第二葉和第二葉，與之前研究認(rèn)為的春梢第三葉［16］或第五葉［7］、夏梢第三葉［6-7］含量最高存在一定的差異。汪毅［5］發(fā)現(xiàn)在新梢莖中沒(méi)有檢測(cè)到EGCG3″Me，而本次研究發(fā)現(xiàn)，在春、夏、秋三季中均發(fā)現(xiàn)莖中含有少量EGCG3″Me，且秋季＞夏季＞春季。存在差異的原因可能與所研究的富含EGCG3″Me的茶樹(shù)品種資源自身遺傳基因不同有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)綠茶中EGCG3″Me含量高于黃茶，黃茶高于青茶，紅茶中未檢測(cè)到。原因是綠茶是新梢通過(guò)高溫殺青使酶失活后干燥加工而成，綠茶的化學(xué)成分與新梢類似，更能有效保持鮮葉中EGCG3″Me含量；而黃茶悶黃工序中，兒茶素類物質(zhì)（EGCG3″Me）發(fā)生了輕度的氧化，青茶作為半發(fā)酵茶，兒茶素類物質(zhì)（EGCG3″Me）發(fā)生了中度的氧化，紅茶則在發(fā)酵過(guò)程中，兒茶素類物質(zhì)（EGCG3″Me）在酶作用下發(fā)生較為徹底的氧化聚合［11］。因此EGCG3″Me含量，不發(fā)酵茶綠茶＞輕度發(fā)酵茶黃茶＞中度發(fā)酵茶青茶＞全發(fā)酵茶紅茶。研究還發(fā)現(xiàn)萎凋可以顯著增加鮮葉中的EGCG3″Me含量，原因可能是萎凋過(guò)程中，EGCG3″Me合成酶活性增加，部分EGCG3″Me由EGCG形成［17］，且茶樹(shù)體內(nèi)的生物合成途徑包括EGCG甲基化形成EGCG3″Me也被證實(shí)［18］；綠茶、黃茶、青茶揉捻工序可顯著增加EGCG3″Me含量，是由于加工過(guò)程中茶葉細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞內(nèi)的甲基化EGCG被提取出來(lái)［9］，而紅茶揉捻工序EGCG3″Me含量顯著下降，是由于紅茶發(fā)酵從揉捻開(kāi)始，其發(fā)酵破壞的EGCG3″Me量大于揉捻增加量造成的。

4　結(jié)論

采用HPLC法對(duì)70份四川茶樹(shù)品種資源新梢中EGCG3″Me含量進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)了富含EGCG3″Me（＞10 mg/g）品種資源三份，包括：蜀茶5號(hào)、金觀音、城西11號(hào)；春、夏、秋季一芽五葉新梢中EGCG3″Me含量最高為秋梢第二葉。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，EGCG3″Me含量在萎凋過(guò)程中顯著增加，但在發(fā)酵過(guò)程中顯著降低，與其他加工方式相比，綠茶、黃茶工藝更能保持鮮葉中EGCG3″Me含量。因此一種生產(chǎn)富含EGCG3″Me茶葉可采摘秋梢一芽二、三葉，并按照綠茶或黃茶工藝加工，且在加工前進(jìn)行適度攤放（輕度萎凋）。

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Analysis of 3″-Methyl-epigallocatechin gallate in Sichuan tea varieties resources

LI Jian-hua1，2，QI Gui-nian1，*，CHEN Sheng-xiang1，ZHU Ming-zhu1
（1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.The Quality Examination Center of Sichuan Tea，Mingshan 625100，China）

3″-Methyl-epigallocatechin gallate（EGCG3″Me）in the young tea leaves of 70 major tea varieties resources in Sichuan were analyzed using HPLC.The results revealed that Shucha 5，Jinguanyin，Chengxi 11 were found to contain higher levels of EGCG3″Me（＞10 mg/g）.The EGCG3″Me levels of different positions of tea line Shucha 5‘five and a bud’shoots from spring to autumn were also analyzed.The results showed that the contents of EGCG3″Me presented first an increasing and then a decreasing trend with the leaf maturity. Compared with the same leaf order，EGCG3″Me contents were increasing.The second leaf in autumn were the highest，the first to the fourth leaves were more than 10 mg/g.The fresh tea leaves in autumn of Shucha 5 were processed to four different types of teas，The EGCG3″Me levels of green tea and yellow tea were the highest，similar to fresh tea leaves，followed by oolong tea.However，black tea do not contain detectable EGCG3″Me. The content of EGCG3″Me increased distinctly during withering.Based on these results，a better way to produce tea leaves rich in EGCG3″Me was proposed，which includes picking fresh tea leaves with two or three leaves and a bud in autumn，processed to green tea or yellow tea，modest spreading（mild withering）before processing.

3″-methyl-epigallocatechin gallate；tea varieties resources；seasons；leaf order；processing

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0108-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.014

2014－11－18

李建華（1984-），女，博士，研究方向：茶葉加工理論與技術(shù)，E-mail：csx810905@163.com。

齊桂年（1956-），男，博士，教授，研究方向：茶樹(shù)育種與精深加工，E-mail：guinian5612@163.com。

四川省科技成果轉(zhuǎn)化重點(diǎn)項(xiàng)目（12CGZHZX0579）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（14ZC1700）；名山茶樹(shù)資源評(píng)價(jià)（063h1300）。