粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1在大腸桿菌中的分泌表達(dá)及其條件優(yōu)化

陳　　環(huán)，薛正蓮，*，王　　洲，張　　爽，蘇燕南，胡艷瑾

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000）

粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1在大腸桿菌中的分泌表達(dá)及其條件優(yōu)化

陳環(huán)1，2，薛正蓮1，2，*，王洲1，2，張爽1，2，蘇燕南1，胡艷瑾1

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000）

克隆粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因plaA，與載體pET-22b（+）連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b（+）-plaA，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌E.coli BL21（DE3）中表達(dá)，構(gòu)建得到重組菌AP22，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白后將培養(yǎng)基蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示：重組蛋白以可溶性蛋白的形式大量存在于發(fā)酵液中，分子質(zhì)量約35 ku，與預(yù)期蛋白大小一致。以磷脂酶A1酶活為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，通過正交實(shí)驗(yàn)得到搖瓶培養(yǎng)最佳條件為：氨芐青霉素終濃度30 μg/mL，IPTG加量0.25 mmol/L，溫度為34℃，OD600值為0.3，誘導(dǎo)時(shí)間4 h。在此條件下重組胞外磷脂酶A1酶活可高達(dá)8.6 U/mL，比優(yōu)化前提高了43.3%。

磷脂酶A1，粘質(zhì)沙雷氏菌，分泌表達(dá)，優(yōu)化

磷脂酶A1廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，能催化磷脂第一位酯酰鍵的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶A1在工業(yè)上主要用于食品和非食品的磷脂乳化劑的修飾，增加油水混合物的乳化以及植物油脫膠等［1-3］。由于磷脂酶A1廣泛的工業(yè)用途，對(duì)其的研究日益廣泛［4］。微生物來源的磷脂酶A1有生產(chǎn)周期短、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于工業(yè)化規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但野生菌株產(chǎn)量低、分離純化困難，而且在食品安全方面存在一定的隱患［5-6］。近年來關(guān)于磷脂酶A1產(chǎn)生菌的研究表明產(chǎn)磷脂酶A1的細(xì)菌種類較多，如蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola），熒光假單胞菌和灰色鏈霉菌等［7-10］。

隨著生物工程相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，基因克隆表達(dá)成為提高磷脂酶A1酶活的有效方式，如Fu等［11］克隆得到一個(gè)嗜冷細(xì)菌沙雷氏菌的磷脂酶A1基因，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)，Michael Givskov等［12］將克隆得到的液化沙雷氏菌（S.liquefaciens）磷脂酶A1基因在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，最終酶活不到1 U/mL，而來自沙雷氏菌MK1的磷脂酶A1基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，經(jīng)條件優(yōu)化后酶表達(dá)量最高為2.21 μg/100m培養(yǎng)基［13］，蘇燕楠等［14］將克隆得到的粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因plaA與載體pET28a連接，導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)，發(fā)酵液酶活僅為0.8 U/mL，主要得到無活性的包涵體，胞外可溶性表達(dá)量低。為了得到高活性、高可溶性表達(dá)的磷脂酶A1，本文采用分子生物學(xué)手段，從前期篩選到的一株產(chǎn)磷脂酶A1菌株粘質(zhì)沙雷氏菌pL-06著手，克隆磷脂酶A1基因plaA，與分泌型質(zhì)粒pET-22b連接，成功構(gòu)建AP22菌株，并對(duì)其誘導(dǎo)分泌條件進(jìn)行了優(yōu)化。

表1　plaA基因擴(kuò)增引物序列Table 1　Gene sequence of primer for plaA gene amplification

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌JM109、粘質(zhì)沙雷氏菌pL-06為本實(shí)驗(yàn)室篩選的高產(chǎn)磷脂酶A1菌株；BL21（DE3）菌株、表達(dá)載體pET-22b（+）（含氨芐青霉素抗性標(biāo)記和pBR322復(fù)制位點(diǎn)，并含有T7、lacI啟動(dòng)子和T7終止子，可進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)） 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自MBI公司；分子生物學(xué)相關(guān)試劑盒和試劑均購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司；其他化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MG96G PCR儀杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；高速勻漿機(jī)上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)SYNGENE公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝科器研究所；全自動(dòng)高壓滅菌鍋華粵行儀器有限公司；PHSJ-3F pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2培養(yǎng)基與試劑

Luria-Bertani培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCL 10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。

氨芐青霉素（Amp）：儲(chǔ)液濃度50 mg/mL，工作濃度50 μg/mL。PLB培養(yǎng)基（卵磷脂+Luria-Bertani）：卵磷脂20 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，0.02%溴甲酚紫30 mL，蒸餾水1000 mL，pH7.0。卵磷脂加少量Tween80用高速勻漿機(jī)乳化后單獨(dú)滅菌。PB緩沖液：pH6.0 0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液。

1.3磷脂酶A1酶活測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T 23535-2009［15］。酶活力定義為：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在45℃和pH6.0條件下，1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol的可滴定脂肪酸，即為1個(gè)酶活力單位（U/g或U/mL）。

1.4磷脂酶A1基因的克隆與表達(dá)

以菌粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06基因組DNA為模板，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增磷脂酶A1基因（plaA）。將擴(kuò)增得到的磷脂酶A1基因plaA經(jīng)EcolⅠ和BamHⅠ雙酶切后與同樣雙酶切的pET22b（+）質(zhì)粒連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐抗性的平板上初篩，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，挑取菌落PCR正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，然后雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒并送生工生物（上海）股份有限公司測(cè)序，引物序列見表1。測(cè)序成功后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建工程菌AP22，涂布于含有氨芐青霉素的PLB培養(yǎng)基，根據(jù)是否有水解暈圈篩選陽性克隆。

1.5重組菌誘導(dǎo)酶活的初步測(cè)定及SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)

挑取AP22單克隆接種至5 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基中200 r/min過夜培養(yǎng)，按2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG繼續(xù)培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)結(jié)束后分別對(duì)發(fā)酵液、發(fā)酵上清和破碎菌體進(jìn)行酶活測(cè)定，并用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后取樣制備蛋白質(zhì)樣品，制備方法參照文獻(xiàn)［16］。

1.6重組菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從平板上挑取AP22、P22［pET-22b（+）/BL21（DE3）］單菌落接種于裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，按2%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌體OD值生長(zhǎng)至0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)并開始計(jì)時(shí)，每隔1 h取樣測(cè)OD600值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)做該重組菌的生長(zhǎng)曲線。

1.7AP22誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件的單因素實(shí)驗(yàn)

接2 mL過夜活化的AP22菌液至100 mL LB培養(yǎng)基中，分別從誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度，加入IPTG時(shí)的OD值、IPTG加量和氨芐青霉素（Amp）濃度五個(gè)方面通過改變單因子的方法進(jìn)行誘導(dǎo)優(yōu)化AP22產(chǎn)酶條件。誘導(dǎo)時(shí)間分別為：2、4、6、8、10、12 h；誘導(dǎo)溫度分別為：25、30、37、42℃；加入IPTG時(shí)的OD值分別為：0.2、0.5、0.8、1.0、1.2；IPTG加量分別為：0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L；Amp加量分別為：10、25、50、100、150、200 μg/mL；誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行酶活定量測(cè)定。參照文獻(xiàn)［13］初步選定在氨芐青霉素終濃度100 μg/mL，IPTG加量0.2 mmol/L，溫度為37℃，OD600值為0.8條件下開始進(jìn)行單因素優(yōu)化。

1.8AP22誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件的正交實(shí)驗(yàn)

表2　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2　Factors and levels for orthogonal array design

從以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，氨芐青霉素（Amp）終濃度，IPTG加量，誘導(dǎo)溫度，加入IPTG時(shí)的OD值四個(gè)因素對(duì)磷脂酶A1酶活影響較大，因此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了四因素三水平對(duì)磷脂酶A1產(chǎn)酶條件進(jìn)一步優(yōu)化。4個(gè)因素分別記做A、B、C、D，各因素均取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。因素水平表見表2。

1.9驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.10數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.0，方差分析使用軟件SPSS 18.0。

2　結(jié)果與討論

2.1磷脂酶A1基因的擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增磷脂酶A1基因，瓊脂糖凝膠電泳表明在約1000 bp處有明顯的條帶如圖1（a）所示。將擴(kuò)增產(chǎn)物及原核表達(dá)載體pET-22b（+）用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pET-22b-plaA重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1（c）所示。DNA測(cè)序鑒定結(jié)果與NCBI公布的磷脂酶A1基因序列（genbank登錄號(hào)：JX138535）比對(duì)，結(jié)果顯示該片段序列完整且閱讀框正確，表明原核表達(dá)載體pET22b（+）-plaA構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功后的表達(dá)載體pET22b（+）-plaA轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21（DE3），結(jié)果如圖1（b）所示，挑取有水解圈的菌落即為陽性克隆。

圖1　目的基因擴(kuò)增結(jié)果、重組菌的篩選和plaA-pET-22b（+）雙酶切驗(yàn)證圖Fig.1　PCR amplification of the target gene，Screening of recombinant stains and Double digest analysis of plaA-pET-22b（+）

2.2重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒plaA-pET-22b（+）轉(zhuǎn)化至感受態(tài)表達(dá)菌株BL21（DE3）中，按上述1.5節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)及SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果如圖2所示，在發(fā)酵液、細(xì)胞破碎上清和破碎沉淀中均有特異性條帶，因此構(gòu)建的重組菌plaA-pET-22b（+）/BL21（DE3）成功表達(dá)了分子質(zhì)量為35 ku重組蛋白，與預(yù)期值相符，說明磷脂酶A1基因plaA在大腸桿菌BL21（DE3）中得以表達(dá)。

圖2　大腸桿菌重組磷脂酶A1的SDS-PAGE電泳Fig.2　SDS-PAGE analysis of recombination plaA

2.3AP22誘導(dǎo)酶活的測(cè)定

如表3所示，重組菌酶活主要在發(fā)酵液中，發(fā)酵上清和破碎菌體中酶活之和基本上與發(fā)酵全酶活即發(fā)酵液酶活相等，說明有活性的磷脂酶A1大量分泌到胞外，便于后續(xù)AP22產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，為了操作方便后續(xù)條件優(yōu)化均選擇發(fā)酵液作為粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。

表3　酶活測(cè)定Table 3　Enzyme assay

2.4重組菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

如圖3所示，AP22和P22生長(zhǎng)情況基本一致，而在AP22中加入IPTG后生長(zhǎng)受到了抑制，可以認(rèn)為基因plaA本身對(duì)重組菌的生長(zhǎng)沒有影響，但是經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后生長(zhǎng)受到抑制，一方面可能是IPTG本身有毒性，對(duì)菌體生長(zhǎng)也有一定程度毒害作用，另一方面可能是由于磷脂酶A1對(duì)宿主細(xì)菌的毒性，磷脂酶A1的高活性表達(dá)對(duì)于宿主菌往往是致命的，會(huì)導(dǎo)致其菌體自溶導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)變慢［17］。

圖3　重組菌生長(zhǎng)曲線Fig.3　Growth curve of recombinant strain

2.5AP22單因素誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定誘導(dǎo)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)外源蛋白表達(dá)量的多少有較大影響，誘導(dǎo)時(shí)間過短目的產(chǎn)物沒有充分表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)量低，由于IPTG和目的產(chǎn)物磷脂酶A1對(duì)菌體都有一定的毒害作用，所以誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)菌體可能發(fā)生自溶［17］，影響目的產(chǎn)物表達(dá)量。因此，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)磷脂酶A1有較大影響。按照1.7節(jié)方法進(jìn)行最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定。結(jié)果如圖4所示，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活有一定程度的影響，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶活增加，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí)酶活性最高，隨后隨著時(shí)間的遞增而逐漸減小，因此確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

圖4　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.4　Effect of induction time on enzyme activity

2.5.2最佳IPTG濃度的確定IPTG作為誘導(dǎo)劑能啟動(dòng)lac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，使目的基因得以表達(dá)，但是IPTG本身對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定抑制作用，并且價(jià)格昂貴，所以IPTG的添加量并不是越高越好，因此，確定最佳的IPTG濃度非常重要。在最佳誘導(dǎo)時(shí)間條件下按照1.7節(jié)方法探討IPTG濃度對(duì)產(chǎn)磷脂酶A1的影響。由圖5可知，IPTG濃度對(duì)酶活影響較為明顯，隨著IPTG濃度的增加酶活明顯提高，在IPTG濃度為0.2 mmol/L時(shí)酶活最高，隨著IPTG濃度的增加反而降低，所以最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L。

圖5　IPTG濃度對(duì)酶活的影響Fig.5　Effect of IPTG concentration on enzyme activity

2.5.3最佳氨芐青霉素濃度的確定隨細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的增加β-內(nèi)酰氨酶將逐漸釋放到溶液中去，降解溶液中的Amp［18］，不具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的表達(dá)菌又失去了選擇壓力，造成大部分新生細(xì)菌無質(zhì)粒，表現(xiàn)為表達(dá)困難，由于Amp本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，所以Amp濃度并不是越高越好，因此合適的Amp濃度至關(guān)重要。在最佳誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度條件下，按照1.7節(jié)方法對(duì)Amp濃度對(duì)產(chǎn)磷脂酶A1的影響進(jìn)行了探討。結(jié)果如圖6所示，Amp濃度對(duì)產(chǎn)磷脂酶A1有較大影響，當(dāng)Amp濃度為50 μg/mL時(shí)酶活最高，高于50 μg/mL時(shí)酶活逐漸下降，因此確定最佳Amp濃度為50 μg/mL。

圖6　Amp濃度對(duì)酶活的影響Fig.6　Effect of Amp concentration on enzyme activity

2.5.4最佳誘導(dǎo)起始OD的確定誘導(dǎo)起始OD對(duì)菌體產(chǎn)酶有著較大影響，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)，細(xì)菌旺盛生長(zhǎng)，代時(shí)最短，細(xì)胞代謝最強(qiáng)，體內(nèi)各種酶的代謝都處于旺盛階段，此時(shí)誘導(dǎo)利于外源蛋白的合成。若誘導(dǎo)時(shí)間過早，由于菌體量太少可能會(huì)降低外源蛋白產(chǎn)量；若誘導(dǎo)時(shí)間過遲，由于細(xì)菌過老自身代謝能力下降，所以不利于外源基因表達(dá)。在最佳誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG和Amp濃度條件下，按照1.7節(jié)方法進(jìn)行最佳誘導(dǎo)起始OD的確定。結(jié)果如圖7所示，OD600值為0.5時(shí)酶活最高，隨著起始OD600值的增加酶活明顯下降，所以確定最佳誘導(dǎo)起始OD600為0.5。

圖7　誘導(dǎo)OD對(duì)酶活的影響Fig.7　Effect of induction OD on enzyme activity

圖8　誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活力的影響Fig.8　Effect of induction temperature on enzyme activity

2.5.5最佳誘導(dǎo)溫度的確定大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度是37℃，若誘導(dǎo)溫度過高易使重組蛋白折疊錯(cuò)誤，使目的蛋白大量以無活性的包涵體形式存在，降低胞外酶活。若溫度過低會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，從而影響重組蛋白表達(dá)，所以誘導(dǎo)溫度對(duì)胞外酶活至關(guān)重要。在最佳單因素條件下按照1.7節(jié)方法進(jìn)行最佳誘導(dǎo)溫度的確定。結(jié)果如圖8所示，誘導(dǎo)溫度過高嚴(yán)重降低了酶活，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)酶活最高，誘導(dǎo)溫度低于30℃時(shí)酶活也有一定程度的下降，所以確定30℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

綜上所述，由單因素實(shí)驗(yàn)得到的重組大腸桿菌AP22誘導(dǎo)條件為：在含有終濃度為50 μg/mL Amp的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.5時(shí)加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

2.5.6正交實(shí)驗(yàn)表4結(jié)果說明，各因素對(duì)磷脂酶A1酶活的影響程度依次為誘導(dǎo)OD值（D）＞誘導(dǎo)溫度（C）＞IPTG加量（B）＞氨芐青霉素終濃度（A），由方差分析表5得知四因素對(duì)酶活的影響都較為顯著。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，確定誘導(dǎo)AP22得到磷脂A1酶活的最佳條件為A1B3C3D1，即抗生素濃度30 μg/mL，IPTG濃度0.25 mmol/L，溫度為34℃，OD值為0.3，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

表4　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　Results of the orthogonal test

表5　正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 5　Variance analysis of orthogonal results

2.5.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照最佳誘導(dǎo)優(yōu)化條件，即抗生素濃度30 μg/mL，IPTG濃度0.25 mmol/L，溫度為34℃，OD600值為0.3，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到磷脂酶A1平均酶活為8.6 U/mL。

3　結(jié)論

通過磷脂酶A1基因與pET-22b（+）載體的連接，成功實(shí)現(xiàn)了磷脂酶A1的原核表達(dá)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，得出最佳誘導(dǎo)條件，使重組磷脂酶A1發(fā)酵液酶活達(dá)由正交實(shí)驗(yàn)前的6.0 U/mL提高到8.6 U/mL，比在pET-28a（+）載體中表達(dá)2.3 U/mL［14］的酶活提高了2.7倍，由此說明帶有T7和lacI啟動(dòng)子的pET-22b（+）質(zhì)粒具有較強(qiáng)的啟動(dòng)能力，適用于表達(dá)毒性較大的基因，并且有利于重組蛋白分泌到胞外，獲得最大產(chǎn)量的可溶、有活性、正確折疊及可分泌到培養(yǎng)基中的磷脂酶A1蛋白，從而簡(jiǎn)化后續(xù)分離提純實(shí)驗(yàn)，對(duì)低成本生產(chǎn)的微生物來源的磷脂酶A1具有重要意義，而且可為利用大腸桿菌生產(chǎn)分泌型重組異源蛋白提供進(jìn)一步的技術(shù)措施。后續(xù)工作將利用其N端His標(biāo)簽進(jìn)行分離純化，獲得的純酶用于研究重組磷脂酶A1的酶學(xué)性質(zhì)及一些應(yīng)用。

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Secretive expression and optimized condition of phospholipase A1 gene from Serratia marcescens PL-06 in Escherichia coli

CHEN Huan1，2，XUE Zheng-lian1，2，*，WANG Zhou1，2，ZHANG Shuang1，2，SU Yan-nan1，HU Yan-jin1
（1.Institute of Biologic，Chemical Engineering of Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Microorganism Fermentation Engineering and Technology Research Center of Anhui Province，Wuhu 241000，China）

The phopholipase A1 gene from Serratia marcescens PL-06 named plaA was cloned，ligased with pET-22b（+）to construct recombinant plasmid pET-22b（+）-plaA and then transferred to E.coli BL21（DE3）. The engineered stains expressing phospholipase A1 was obtained，and named AP22.After subsequent indution by IPTG，lots of approximately 35 ku protein was detected in the fermented liquid by SDS-PAGE.This protein was in the same size with the expected protein.Selectioning phospholipase A1 enzyme activity as reference，by single factor and orthogonal experiment method，optimized induction conditions for phopholipase A1 expression were obtained as follows：ampicillin concentration 30 μg/mL，IPTG concentration 0.25 mmol/mL，inducing temperature 34℃，strain density OD6000.3 and induction time 4 h.Under the optimized conditions，maximum phospholipase A1 enzyme activity was observed to be 8.6 U/mL and increased by 43.3%than before.

phospholipase A1；Serratia marcescens；secretory expression；optimization

TS201.2

A

1002-0306（2015）16-0193-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.031

2014－11－18

陳環(huán)（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化，E-mail：chenhuan0206@126.com。

薛正蓮（1967-），女，碩士，教授，研究方向：工業(yè)微生物育種及發(fā)酵過程控制、酶的生產(chǎn)及應(yīng)用、微生物制藥等，E-mail：xuezl@ahpu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金（C200504）；安徽省自然科學(xué)基金（11040606M81）。