干旱脅迫下辣椒幼苗光合與熒光參數(shù)測(cè)定的最佳葉片

張澤宇,曹紅霞,裴書瑤,李曼寧

(西北農(nóng)林科技大學(xué)水利與建筑工程學(xué)院旱區(qū)農(nóng)業(yè)水土工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

光合作用是作物生長(zhǎng)最基本的生理過程之一，作物有機(jī)物的積累都是通過直接或間接地改善作物的光合生理性能來實(shí)現(xiàn)[1]。植物葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，葉片中的光合色素是葉片光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，葉綠素含量的高低在很大程度上反映了植株的生長(zhǎng)狀況和葉片的光合能力，并與葉片光合強(qiáng)度密切相關(guān)[2]。為了維持葉綠素分子吸收光能的平衡，除了光合作用消耗的能量外，光合器官將其余光能以熒光和熱的形式散失。其中葉綠素?zé)晒饽芸焖凫`敏地反映植物光系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)狀況[3-4]。隨著植物光合作用研究的深入，越來越多的植物學(xué)科如農(nóng)學(xué)、林學(xué)、植物生理學(xué)、植物生態(tài)學(xué)、園藝學(xué)和遺傳學(xué)的研究均涉及到葉片光合、熒光作用的測(cè)定[5]。目前用于測(cè)定光合、熒光參數(shù)的儀器一般是針對(duì)于植物葉片的，因此在對(duì)葉片的選擇上，應(yīng)該盡量選擇有代表性的葉片，這對(duì)于光合、熒光參數(shù)測(cè)定代表性起著決定性的作用。在以往的研究中，學(xué)者們普遍選擇功能葉來測(cè)量葉綠素含量、氣體交換參數(shù)及葉綠素?zé)晒獾葏?shù)，以對(duì)植株的光合潛力進(jìn)行評(píng)價(jià)。比如，通常選擇小麥完全展開的旗葉[6]、棉花的第三片或第四片葉[7]和完全展開的番茄幼葉[8]來量化光合作用?？偟膩碚f，所選擇的葉片都是充分展開并維持較高光合速率，能為植株提供有機(jī)養(yǎng)料的葉片[9-10]。但是這些研究并沒有考慮不同環(huán)境條件下功能葉片的變化。有研究得出，在脅迫條件下，如干旱脅迫，葉片會(huì)經(jīng)歷一系列的變化。水分缺乏可能通過削弱抗氧化系統(tǒng)中CAT、POD和SOD的活性而加速葉片衰老。衰老葉片下調(diào)Rubisco活性/表達(dá)，導(dǎo)致葉綠素降解，影響光合作用[11]。此外，由于葉片在不同位置的生長(zhǎng)發(fā)育階段不同，不同葉片對(duì)能量的需求也不同。根據(jù)植物生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，成熟早的葉后期光合能力會(huì)下降；而剛展開的葉，以輸入有機(jī)物為主，只有那些剛達(dá)到最大面積的葉才是光合產(chǎn)物的主要貢獻(xiàn)者。然而，這些葉片的光合作用對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)可能存在顯著差異[12]。因此，在干旱條件下哪個(gè)葉位最適宜進(jìn)行光合、熒光參數(shù)測(cè)量還有待深入研究。

辣椒(Capsicumgenus)屬于茄科辣椒屬，是一年或多年生草本植物，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美而大量應(yīng)用于食品、中藥行業(yè)，并在世界各地廣泛栽培[13]。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上來看，辣椒屬于淺根系植物，根細(xì)而弱，木栓化程度高，因此極易受干旱影響[14-15]。在以往的研究中，有學(xué)者選擇辣椒完全展開的第1片、第3片或第4片功能葉來測(cè)量光合、熒光參數(shù)[16-18]。但是在干旱脅迫下，哪個(gè)葉位對(duì)水分脅迫最敏感，最適宜測(cè)定光合、熒光參數(shù)還有待深入研究。

因此，本研究通過分析辣椒幼苗1～6葉位在不同干旱脅迫程度下葉綠素含量、氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉面積的變化，探索干旱條件下不同葉位的適應(yīng)性機(jī)制，選擇出對(duì)水分脅迫最敏感的一個(gè)功能葉作為干旱條件下最適宜測(cè)定光合、熒光參數(shù)的典型葉片，以期為干旱條件下光合作用的快速評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2020年5—7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)農(nóng)業(yè)水土工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室日光溫室內(nèi)進(jìn)行(34°17′N、108°01′E，海拔521 m)。該區(qū)屬暖溫帶季風(fēng)半濕潤(rùn)氣候，多年平均降水量632 mm，主要集中在6—10月，年均蒸發(fā)量1 500 mm。多年平均氣溫12.5℃，年均日照時(shí)數(shù)2 163.8 h,無霜期210 d。供試材料為辣椒，品種為“世紀(jì)紅”。試驗(yàn)土壤為重壤土，取自西北農(nóng)林科技大學(xué)附近0～20 cm 表土層，土壤容重1.4 g·cm-3，田間持水量33.6%(體積含水率)。

采用育苗移栽的方式種植，待4葉1心時(shí)定植(2020年5月29日),在定植前施基肥：每盆施0.071 g尿素(N：46.4%)、0.314 g磷酸二銨(P2O5：42%，N：15%)、0.404 g硫酸鉀(K2O：54%)。定植后澆一次緩苗水，隔兩周后(6葉期)開始水分脅迫處理，每天18∶00 采用稱重法補(bǔ)水，使土壤含水率維持在設(shè)定范圍內(nèi)。試驗(yàn)設(shè)有3個(gè)水分處理，即土壤相對(duì)含水率分別為土壤田間持水率的75%～85%(對(duì)照組CK)、65%～75%(輕度脅迫MS)和55%～65%(重度脅迫SS)。在土壤相對(duì)含水量達(dá)到各處理相應(yīng)脅迫程度的第10、13、16天(8葉期)對(duì)辣椒幼苗從上到下完全展開的1～6葉位進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定及取樣，每處理重復(fù)3次。采用盆栽方法，盆大小為:上口直徑×下底直徑×高為14.7 cm×9.1 cm×11.4 cm，每盆裝土1 kg。試驗(yàn)過程中，每盆種植1株辣椒，每個(gè)處理10株，共種植30株。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

(1)氣體交換參數(shù)。在各處理每一重復(fù)的3盆中隨機(jī)取1盆，共取3盆，從頂端向下選取完全展開的1～6片葉，采用Li-6800便攜式光合儀在晴天9∶00—11∶00測(cè)定凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)及蒸騰速率(Tr)。

(2)葉面積及葉綠素?zé)晒鈪?shù)。應(yīng)用PlantScreen植物表型成像系統(tǒng)FluorCam 700 MF (Photon Systems Instruments, Czech Republic)對(duì)各葉位葉片的葉面積及熒光參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。暗處理30 min后放入表型成像系統(tǒng)中，測(cè)定暗適應(yīng)后的最小熒光(F0)、葉片的PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

(3)葉綠素及類胡蘿卜素含量。應(yīng)用80%丙酮提取各葉位葉綠素及類胡蘿卜素，再用分光光度計(jì)測(cè)量各色素的吸光度，通過Beer-Lambert公式計(jì)算其濃度：

Chla=12.21×A663-2.81×A646

Chlb=20.13×A646-5.03×A663

Car=(1000×A470-3.27×Chla-104×Chlb)/229

TChl=Chla+Chlb

再按以下公式計(jì)算各色素含量：

式中，C為葉綠體色素的濃度(mg·L-1)，F(xiàn)W為鮮重(g)，VT為提取液總體積(mL),n為稀釋倍數(shù)。

將水分脅迫后第10、13、16天3 d測(cè)量結(jié)果取平均值作為實(shí)際測(cè)量結(jié)果，采用Microsoft Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；使用SPSSv.21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙因素方差分析，使用Tukey檢驗(yàn)在P<0.05及P<0.01的顯著性水平上進(jìn)行多重比較，并應(yīng)用OriginPro 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對(duì)辣椒幼苗不同葉位氣體交換參數(shù)的影響

水分脅迫對(duì)辣椒幼苗不同葉位氣體交換參數(shù)的影響見圖1。由表1可知，水分處理(W)、葉位(L)及水分與葉位的交互作用(L×W)對(duì)Pn、Gs、Ci和Tr的影響均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。由圖1A、1B、1D可知，在相同水分處理下，隨著葉位的增加(1～6葉位)，Pn、Gs和Tr先升高后降低。其中，充分供水時(shí)，Pn、Gs和Tr均在第3葉位達(dá)到最大值，分別為5.81、0.08、4.42 mmol·m-2·s-1，并與其他葉位呈顯著差異(P<0.05)；而在水分脅迫時(shí)(MS、SS)，Pn、Gs和Tr均在第4葉位達(dá)到最大值。對(duì)于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，1～3葉位的Pn、Gs和Tr逐漸下降，4～6葉位的各參數(shù)值先升高后降低，在MS處理下取得最大值。

表1 水分處理、葉位及其交互作用對(duì)氣體交換參數(shù)影響的顯著性分析Table 1 Significance analysis of water treatment, leaf position and their interactions on gas exchange parameters

Ci的變化趨勢(shì)與Pn、Gs和Tr相反。由圖1C可知，在相同水分處理下，隨葉位的增加，Ci先降低后升高。其中，在充分供水時(shí)，第3葉位的Ci值最小，為235.94 μmol·mol-1，而在水分脅迫時(shí)(MS、SS)，第4葉位的Ci值最小，分別為242.58 μmol·mol-1和256.45 μmol·mol-1。對(duì)于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，1～3葉位的Ci值逐漸增大，4～6葉位的Ci值先降低后升高，MS處理Ci值下降程度最大。

注：不同大寫字母表示水分處理間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示葉位間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different capital letters indicated significant difference between water treatments (P<0.05); Different lowercase letters indicate significant difference between leaf positions (P<0.05). The same below.圖1 不同處理下辣椒幼苗不同葉位氣體交換參數(shù)Fig.1 Gas exchange parameters of pepper seedling at different leaf positions under different treatment

2.2 水分脅迫對(duì)辣椒幼苗不同葉位葉面積的影響

水分脅迫對(duì)辣椒幼苗不同葉位葉面積的影響見圖2。水分處理、葉位及水分與葉位的交互作用均對(duì)葉面積產(chǎn)生了極顯著的影響(P<0.01)。由圖2可知，不同葉位葉面積的變化趨勢(shì)和Pn相似，在相同水分處理下，隨著葉位的增加，葉面積先增大后減?。欢蝗~位，隨著水分脅迫程度的增大，1～3葉位的葉面積逐漸減小，4～6葉位的葉面積先升高后降低。其中，在充分供水時(shí)，第3葉位的葉面積最大，為2 800.67 mm2，受干旱脅迫時(shí)(MS和SS),第4葉位的葉面積最大，分別達(dá)到了2 919.31 mm2和2 051.26 mm2。

圖2 不同處理下辣椒幼苗不同葉位葉面積Fig.2 Leaf area of pepper seedling at different leaf positions under different treatments

2.3 水分脅迫對(duì)辣椒幼苗不同葉位葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

辣椒幼苗不同葉位葉綠素?zé)晒鈪?shù)受水分處理、葉位及水分與葉位的交互作用影響極顯著(P<0.01)(表2)。由圖3A、3D可知，同一水分處理下，隨葉位增加，F(xiàn)0與NPQ均為先降低后升高的趨勢(shì)，其中，在充分供水時(shí)，第3葉位的F0與NPQ值最小，分別為264.75和0.68；而在水分脅迫時(shí)(MS和SS)，第4葉位的F0與NPQ值最小。對(duì)于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，F(xiàn)0逐漸增加，而NPQ在1～3葉位逐漸增加，4～6葉位卻先降低后增加，在MS處理時(shí)的值最小。

表2 水分處理、葉位及其交互作用對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的顯著性分析Table 2 Significance analysis of water treatment, leaf position and their interactions onchlorophyll fluorescence

Fv/Fm、qP的變化趨勢(shì)與F0、NPQ相反。由圖3B、3C可知，在相同水分處理下，隨葉位增加，F(xiàn)v/Fm與qP先增加后降低，在第3葉位達(dá)到最大值；對(duì)于同一葉位，隨水分脅迫程度的增加，1～3葉位的qP逐漸下降，4～6葉位的qP先升高后降低，其中，MS處理4～6葉位的qP較CK分別增加12.53%、11.27%及14.30%。干旱脅迫顯著降低了各葉位的Fv/Fm，且隨著脅迫程度的增加，F(xiàn)v/Fm逐漸下降。在MS與SS處理，第4葉位的Fv/Fm值最大，分別為0.78和0.70。

圖3 不同處理下辣椒幼苗不同葉位葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.3 Chlorophyll fluorescence of pepper seedling at different leaf positions under different treatments

2.4 水分脅迫對(duì)辣椒幼苗不同葉位光合色素的影響

由表3可知，在相同水分處理下，Chla、Chlb、Car及TChl含量隨葉位的增加先升高后降低，其中，在充分供水條件下，第3葉位的色素含量最多，在水分脅迫下(MS、SS)，第4葉位的色素含量最多。而對(duì)于同一葉位，隨著水分脅迫程度的增加，1～3葉位的色素含量逐漸降低，4～6葉位的色素含量先增加后降低，其中，MS處理4～6葉位的TChl含量較CK分別增加了14.44%、15.12%與20.83%。水分處理、葉位及水分與葉位的交互作用對(duì)各色素含量均產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)。

3 討 論

本研究表明在充分供水條件下，隨葉位的增加，Pn、Gs和Tr的變化趨勢(shì)與Ci相反，呈倒“V”形(圖1)。由于上部葉位葉片剛剛形成，幼葉生長(zhǎng)旺盛，但許多內(nèi)部結(jié)構(gòu)還不完善，所以凈光合速率相對(duì)較低。但隨著葉片成熟，葉片結(jié)構(gòu)逐漸完整，光合色素含量增加(表3)，各種調(diào)節(jié)機(jī)制逐步完善，凈光合速率相對(duì)較高，其中，第3葉位的凈光合速率最高。當(dāng)葉片逐漸衰老，其組織結(jié)構(gòu)開始遭到破壞，發(fā)生光合衰退、葉綠素逐步分解(表3)，細(xì)胞代謝水平下降，導(dǎo)致葉片光合能力也不斷下降[19]。在水分脅迫條件下，植物通過調(diào)整氣孔開閉程度來控制水分、氣體交換，氣孔開閉程度直接調(diào)節(jié)了氣孔導(dǎo)度。氣孔關(guān)閉在限制了水分向大氣散失的同時(shí)也限制了CO2進(jìn)入氣孔腔[20-21]。在本研究中，水分虧缺使各葉位(除4～6葉位)Pn,Gs和Tr顯著降低(圖1A、1B、1D)，由于Pn下降，消耗的CO2減少，導(dǎo)致Ci增加(圖1C)。但在水分脅迫條件下(MS、SS)，第4葉位的Pn、Gs和Tr較其他葉位更高，說明此葉位應(yīng)對(duì)干旱脅迫的能力更強(qiáng)。在充分供水條件下，隨葉位增加，葉面積先增大后減小，其中第3葉位的葉面積最大。而干旱脅迫降低了各葉位的葉面積(除MS處理4～6葉位葉面積增加外)，這可能是由于膨壓損失、光合作用和能量供應(yīng)減少，細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)受到干擾引起的[22-23]。但在水分脅迫條件下，第4葉位的葉面積最大，MS處理下的葉面積甚至比CK更大，可能是因?yàn)榈?葉早于第3葉，受水分脅迫時(shí)第4葉基本達(dá)到最大面積，后期受影響小，而第3葉和2、1葉正在生長(zhǎng)中，所以受影響較大。在本研究中，第3葉位光合參數(shù)及葉面積的變異系數(shù)均大于第4葉位，對(duì)水分脅迫更加敏感(表4)。光合色素能吸收光能，對(duì)植物來說至關(guān)重要，而色素濃度又易受葉齡及水分脅迫的影響[24-25]。在本研究中，充分供水條件下，葉綠素含量的變化趨勢(shì)與Pn相似，表明Chla、Chlb和TChl隨葉片成熟逐漸增加，在第3葉位達(dá)到最大值，這與Li等[26]的研究結(jié)果相似。而葉綠素含量與Pn在4～6葉位逐漸下降，可能是由于葉片衰老引起的(表3)。MS和SS處理各葉位的Chla, Chlb和TChl (除MS處理4～6葉位色素含量增加外)降低，這是氧化脅迫的典型特征，可能是由色素光氧化及葉綠素降解產(chǎn)生的。Car既是一種光合色素，也是一種內(nèi)源性抗氧化劑，在光合作用和光保護(hù)中起著重要作用[27]。在本研究中，干旱脅迫降低了Car含量(除MS處理4～6葉位Car含量增加外)(表3)，植物猝滅活性氧的能力降低，細(xì)胞內(nèi)積累了更多氧自由基，葉綠體的膜結(jié)構(gòu)破壞，加速葉綠素的分解[28]。水分脅迫下第4葉位的各光合色素含量最多，對(duì)于其維持較高的光合能力具有重要作用。為了維持葉綠素分子吸收光能的平衡，光合器官應(yīng)用了不同的策略，包括光吸收、光化學(xué)和光保護(hù)。其中最廣泛的光保護(hù)機(jī)制之一是以熱的形式在光系統(tǒng)II天線中耗散多余的光能，這參與了葉綠素?zé)晒獾姆枪饣瘜W(xué)猝滅(NPQ)[29]。有研究得出，NPQ的變化趨勢(shì)與Pn相反[30]。在本研究中，隨葉位增加，NPQ先降低后升高，且隨著水分脅迫程度的增加，各葉位的NPQ逐漸增加(除MS處理4～6葉位NPQ降低外)，其中，第4葉位的NPQ在MS處理時(shí)最低，說明此時(shí)該葉片將更多的能量應(yīng)用于光化學(xué)反應(yīng)(圖3D)。qP值近似于PSII反應(yīng)中心開放的比例，代表光合作用消耗的能量[31]。在本研究中，qP和Pn的變化趨勢(shì)相似，干旱脅迫下，qP值降低(除MS處理4～6葉的qP增大外)，說明干旱脅迫降低了葉片的光轉(zhuǎn)換能力(圖3C)，其中CK第3葉位的qP最大，光轉(zhuǎn)換能力最強(qiáng)；水分脅迫時(shí)，第4葉位的qP最大，光轉(zhuǎn)換能力最強(qiáng)。F0為暗適應(yīng)下最小熒光，代表了PSII反應(yīng)中心的破壞程度[32-33]。本研究結(jié)果顯示，在充分供水條件下，隨著葉片的成熟(1～3葉位)Pn逐漸增加，F(xiàn)0逐漸減?。欢S著葉片衰老(4～6葉位)，Pn逐漸減小，F(xiàn)0逐漸增加。此外，F(xiàn)0隨干旱脅迫程度的增加顯著增加(圖3A)，這可能是由于光系統(tǒng)II (D1蛋白和PS的其他部分)的降解或能量向反應(yīng)中心轉(zhuǎn)移中斷引起的[4]。在水分脅迫時(shí)，第4葉位的F0最小，PSII反應(yīng)中心的破壞程度最小。Fv/Fm可以用來反映PSII的最大效率(所有PSII中心開放時(shí)的效率)[34]。在充分供水條件下，1～3葉位的Fv/Fm逐漸增加說明植物的光能利用效率逐漸增強(qiáng)(圖3B)。而隨著葉片衰老及干旱脅迫程度的增加，F(xiàn)v/Fm顯著下降，這可能是由于PSII反應(yīng)中心同化能力下調(diào)及葉綠素含量降低導(dǎo)致的[35-36]。充分供水時(shí)，第3葉位的Fv/Fm最大，水分脅迫時(shí)，第4葉位的Fv/Fm最大，但第3葉位對(duì)水分脅迫更加敏感，其變異系數(shù)較第4葉位更大(表4)。

表3 不同處理下辣椒幼苗不同葉位光合色素含量Table 3 Photosynthetic pigments content of pepper seedling at different leaf positions under different treatments

表4 水分脅迫下辣椒幼苗第3、4葉位各參數(shù)的變異系數(shù)Table 4 Variation coefficient of parameters at 3rd and 4th leaf positions of pepper seedling under water stress

4 結(jié) 論

在充分供水時(shí)，隨葉位的增加，Pn、Gs、Tr、葉面積、光合色素含量、qP、Fv/Fm均呈先增加后降低的趨勢(shì)。其中，第3葉位的光合色素含量最多，Pn、qP、Fv/Fm最大，NPQ、F0最小，說明與其他葉位相比，充分供水時(shí)第3葉位的光轉(zhuǎn)換能力及光能利用效率更強(qiáng)。而在干旱脅迫時(shí)，隨著脅迫程度的增大，各參數(shù)逐漸降低(除Ci、F0、NPQ外)，其中，第4葉位的光合色素含量最多，這對(duì)于其維持較高的光合能力具有重要作用。與其他葉位相比，第4葉位的qP、Fv/Fm最大，NPQ、F0最小，說明與其他葉位相比，受干旱脅迫時(shí)第4葉位的PSII反應(yīng)中心的破壞程度更小，光轉(zhuǎn)換能力及光能利用效率更強(qiáng)，并將更多的能量應(yīng)用于光化學(xué)反應(yīng)。第3、4葉位是對(duì)辣椒幼苗生長(zhǎng)具有主要貢獻(xiàn)的葉片，但在水分脅迫條件下，第3葉位光合參數(shù)、葉面積、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變異系數(shù)較第4葉位更大，說明第3葉位對(duì)于水分脅迫更加敏感。因此，在干旱脅迫試驗(yàn)中，宜選用第3葉位測(cè)量辣椒幼苗光合、熒光參數(shù)。