鼠動靜脈畸形模型在放射外科治療后炎癥分子的改變

蘇海洋　申俊峰　羅雷雷等

[摘要] 目的 探索鼠模型動靜脈畸形在放射外科治療后血清中炎癥分子的改變，為進一步尋找人類腦動靜脈畸形對放射外科治療反應的早期監(jiān)測標志物奠定基礎。 方法 將12只雄性SD大鼠隨機分成實驗組和對照組，每組6只。利用顯微血管吻合法進行造模，造模后42 d，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗分別定量測定兩組大鼠放療前血清中可溶性E-選擇素、P-選擇素、細胞間黏附分子-1（SICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（SVCAM-1）、組織因子及實驗組放療后6、12、24、48、72、120 h血清中以上各因子的含量，并利用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。 結果 放療后實驗組大鼠血清可溶性E-選擇素及P-選擇素、SICAM-1、SVCAM-1及組織因子較放療前及對照組升高。實驗組放療不同時間點各種炎癥分子的表達有差異：放療后6、12 h時，實驗組血清中可溶性E-選擇素的平均濃度較放療前顯著升高（P < 0.05）；放療后6、12、24、48、72 h時血清中可溶性P-選擇素的水平與放療前比較顯著升高（P < 0.05）；放療后6 h和12 h時，血清中sICAM-1和sVCAM-1的濃度較放療前均顯著升高（P < 0.05）；放療后6 h血漿可溶性組織因子濃度較放療前升高1倍，在放療后24 h內維持在高水平（P < 0.05）。 結論 在放射外科治療動靜脈畸形的過程中在不同時間點對以上炎癥分子進行組合監(jiān)測可作為早期預測動靜脈畸形對于放射外科治療反應的標志物。

[關鍵詞] 動靜脈畸形；模型；E-選擇素；P-選擇素；細胞間黏附分子-1；血管細胞黏附分子-1；組織因子

[中圖分類號] R743.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0009-05

[Abstract] Objective To study serum inflammatory molecular changes in response to radiosurgery in rat model of arteriovenous malformation， and to find the early and effective marker to detect responsiveness after using radiosurgery for human AVMs. Methods 12 male SD rats were randomly divided into experimental group and control group， 6 rats in each group. The rat models of AVMs were built by microvascular anastomosis method， 42 days after modeling， soluble E-selectin and P-selectin， ICAM-1， VCAM-1 and tissue factor in animal model of AVMs were quantified by ELISA before radiosurgery of rats in two groups and 6， 12， 24， 48， 72， 120 hours after radiosurgery of rats in experimental group， and data were analyzed by SPSS 17.0 statistical software. Results Compared with the control group and experimental group before radiotherapy， the serum concentrations of soluble E-selectin and P-selectin， SICAM-1， SVCAM-1， and tissue factor of the rats in the experimental group were significantly increased. The expression of inflammatory molecular changes at different time point in rats of the experimental group had statistically significant difference： serum concentrations of soluble E-selectin were significantly increased at 6 and 12 hours after radiosurgery （P < 0.05）； serum levels of soluble P-selectin were significantly increased at 6，12， 24， 48， 72 hours after radiosurgery （P < 0.05）； serum concentrations of soluble ICAM-1 and VCAM-1 were significantly increased at 6 and 12 hours after radiosurgery （P < 0.05）； serum concentrations of soluble tissue factor were doubled at 6 hours after radiosurgery and maintained at high levels for 24 hours （P < 0.05）. Conclusion A combination of these molecules measured at different time points may serve as an early predictor of responsiveness of AVMs to radiosurgery.

[Key words] AVM； Model； E-selectin； P-selectin； ICAM-1； VCAM-1； TF

腦動靜脈畸形（CAVMs）是中樞神經系統(tǒng)最常見的血管畸形疾病，具有較高的致死率和致殘率，也是造成兒童及成人出血性腦卒中的主要原因之一。目前很多動靜脈畸形（AVMs）可以通過手術及放射外科治愈，但接受放射外科治療的患者因病灶對放療無反應或放療后血管閉塞不完全仍有導致出血的風險[1-2]。目前對于放療后病灶監(jiān)測的金標準是血管造影術，尚無簡便可行的早期監(jiān)測手段。因此，需要尋找簡便可測的分子標志物來預測放療后動靜脈畸形血管的早期反應。根據前期對人腦動靜脈畸形血管、鼠動物模型動靜脈畸形血管內皮細胞的研究[3-7]，故可推斷動物模型血管內皮細胞分子在放療后的表達可能在轉錄水平升高及血液中可能檢測到。本研究的目的是通過探索鼠動脈畸形模型在放射外科治療后炎癥分子的改變，確定動靜脈畸形動物模型內皮分子變化的時間過程，為進一步尋找腦動靜脈畸形對放射外科治療反應的早期監(jiān)測標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用SPF級雄性SD大鼠均由北京世紀壇醫(yī)院動物實驗中心提供，平均體重（364±12）g；顯微手術器械（成套）購自寧波成和顯微器械廠；手術顯微鏡（Zeiss，德國）；X-刀直線加速器（Radionics，Burlington，MA，USA）。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 模型建立及放射外科治療方法

將12只雄性SD大鼠隨機分成實驗組和對照組，每組6只。用標準化鼠籠飼養(yǎng)SD大鼠，每籠3只，1周換2次輔料。根據本研究組前期已發(fā)表的SD大鼠頸動靜脈畸形模型制作[5]的手術方式將SD大鼠的左頸外靜脈端側吻合到左頸總動脈以建立動靜脈畸形動物模型。顯微血管吻合手術在嚴格無菌條件下進行。首先，麻妥后備皮消毒，暴露左頸總動脈（CCA）。然后，暴露左頸外靜脈（EJV），用絲線（10-0）結扎左頸外靜脈近鎖骨下靜脈處。用靜脈夾夾閉大鼠EJV頭端。用動脈夾夾閉CCA的近端及遠端，將其血管壁側面縱行切一小口，用絲線（11-0）將EJV的尾端與切口作端-側吻合。完成吻合后檢查吻合口是否滲漏及堵塞。吻合后形成1條供血動脈（頸總動脈）、1條動脈化靜脈（左頸外靜脈）、1處畸形團（“病灶”）及1條引流靜脈（乙狀竇及橫竇）。逐層閉合切口。待大鼠蘇醒后移至鼠籠單獨飼養(yǎng)至術后1周。術后1周每天評估其體重、運動功能、行為以及傷口狀態(tài)，以后每周評估1次。

術后42 d，肌內注射氯胺酮及咪唑達侖麻醉下對動靜脈畸形處血管行放射外科治療。根據大鼠呼吸頻率評估麻醉深度，依據后肢回撤反應對痛覺反應進行評估。麻醉后，將大鼠置于X-刀直線加速器（Radionics）的頭環(huán)下（圖1），調整動物相對位置于計劃照射的部位，確保瘺管置于3束激光交匯點處。同樣的治療方法適用于所有動物，對鎖骨下區(qū)“病灶”處給予最大劑量25 Gy照射。對照組動物做相同手術處理，但不進行放射治療。分別于放療前（-1 h）及放療后6，12，24，48，72，120 h抽取實驗動物血樣，以備檢測。

1.3 觀測指標及檢測方法

大鼠可溶性E-選擇素（sE-selectin）、可溶性P-選擇素（sP-selectin）、可溶性細胞間黏附分子-1（sICAM-1）、可溶性血管細胞黏附分子-1（SVCAM-1）及可溶性組織因子（sTF）的檢測根據試劑盒說明書進行實驗操作。將血清或血漿樣品稀釋10～20倍，置于包被有特異性兔抗大鼠抗體的ELISA板上孵育。清洗后，加入過氧化物酶標記的抗兔抗體。最后，所有實驗套件中結合酶的活性用過氧化物酶底物四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫底物來測定。450 nm處的吸光度由自動微板讀數器（iMark，Bio-Rad Laboratories）測定。將450 nm波長讀數減去570 nm處參照波長的讀數以糾正微板計數的光學誤差。每次測定的標準曲線用Microplate Manager 6軟件繪制。標準曲線上樣品濃度讀數乘以稀釋倍數即為實際樣品濃度。各組內和各組間測定的精度分別控制在5%和7%。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較，若各組方差齊，采用方差分析，如方差不齊則采用Mann-Whitney非參數檢驗評估。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 放射介導的大鼠血清sE-selectin和sP-selection的變化

圖2中顯示了放射外科治療誘導鼠模型動靜脈畸形血清中可溶性E-selectin和P-selectin的改變。放射可以誘導形成sE-selectin和sP-selectin。實驗組放療前sE-selectin為（11.50±0.01）ng/mL，放療后6 h升高到（20.60±0.01）ng/mL，放療后6 h比放療前升高了（78±1）%，放療后12 h sE-selectin濃度的平均值為（16.95±0.01）ng/mL，比放療前升高了（47±1）%，而在24 h時恢復到了正常水平，放療后24、48、72、120 h血清sE-selectin濃度的平均值分別為（12.11±0.01）、（12.10±0.01）、（10.89±0.01）、（10.90±0.01）ng/mL。實驗組血清sP-selectin的平均濃度在放療前為（85.71±0.01），放療后6、12、24、48、72、120 h分別為（164.27±0.01）、（278.56±0.01）、（644.27±0.01）、（385.70±0.01）、（207.14±0.01）、（100.00±0.01）ng/mL?？梢妔P-selectin在放療后24、42 h時分別升高到了5倍和4倍。在放療后120 h時，sP-selectin恢復到正常水平。對照組血清sE-selectin和sP-selectin平均濃度分別為（11.49±0.01）、（84.85±0.01）ng/mL，與實驗組放療前血清濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.2 放射介導的ICAM-1和VCAM-1的改變

圖3中顯示了鼠模型動靜脈畸形中經放射外科誘導的血清sICAM-1和sVCAM-1的改變。實驗組sICAM-1的血清平均濃度在放射前為（30.88±0.01），放療后6、12、24、48、72、120 h分別為（47.79±0.01）、（59.97±0.01）、（37.50±0.01）、（34.55±0.01）、（31.61±0.01）、（31.60±0.01）ng/mL?？梢妔ICAM-1為在放療后6 h升高了（57±2）%（P < 0.05），12 h時升高到約2倍，在放療120 h時恢復到正常水平。實驗組血清中sVCAM-1平均濃度在放療前為（6.87±0.01）ng/mL，放療后6、12、24、48、72、120 h分別為（11.25±0.01）、（13.54±0.01）、（10.20±0.01）、（7.71±0.01）、（7.08±0.01）、（7.04±0.01）ng/mL?？梢姺派? h后，血清中sVCAM-1升高了（63±1）%（P < 0.05），12 h時，升高至約2倍，放療后24 h時升高（48±1）%，并于120 h恢復至正常水平。對照組血清sICAM-1和sVCAM-1平均濃度分別為（30.25±0.01）、（6.83±0.01）ng/mL，與實驗組放療前血清中濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.3 放射介導的血漿中sTF的變化

圖4顯示了鼠模型動靜脈畸形血液中放射誘導的血清sTF的變化。實驗組sTFs的血清平均濃度在放療前為（28.79±0.01）ng/mL，放療6、12、24、48、72、120 h分別為（59.84±0.01）、（50.00±0.01）、（40.91±0.01）、（30.30±0.01）、（31.06±0.01）、（30.91±0.01）ng/mL?？梢妔TF在放射6，12，24 h后分別升高了（110±6）%、（76±4）%、（42±4）%（P < 0.05），放療后6 h，血漿sTF濃度較放療前升高了1倍，在120 h時恢復至正常水平。對照組血清sTF平均濃度為（28.32±0.01）ng/mL，與實驗組放療前血清濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3討論

根據前期利用免疫組化和透射電子顯微鏡研究放射誘導的人腦動靜脈畸形病灶、鼠動靜脈畸形模型血管的形態(tài)學結構及血管內皮分子表達的研究[3-7]。本研究假設，鼠模型動靜脈畸形血管內皮分子可能在轉錄水平上調，放療后可能在血清或血漿中檢測出來，同時，內皮蛋白分子可能對于監(jiān)測動靜脈畸形血管對放射治療的反應性方面有預測功能。本研究發(fā)現大鼠動靜脈畸形模型中，放射可以誘導血清中sE-selectin、sP-selectin、sICAM-1、sVCAM-1和血漿sTF水平的上調。放療后血漿中可溶性內皮分子檢測時間是決定性因素。放射誘導血清中sE-selectin、sP-selectin、sICAM-1、sVCAM-1及sTF的水平具有時間依賴性。放射誘導的炎癥分子包括sE-selectin、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1[8-9]，它們與sP-selection共同介導了白細胞在內皮上緩慢翻滾最終牢固地黏附[10]。ICAM-1在淋巴細胞的歸巢和遷移中起著重要作用。動靜脈畸形血管中存在多種因素可以刺激E-選擇素（E-selectin）、ICAM-1、VCAM-1的表達[11]。這些刺激因素可以與放療產生協(xié)同作用進一步促進E-選擇素、細胞間黏附分子和ICAM-1表達的上調[12]，從而使得內皮分子表達更具特征性。放療后早期效應是內皮細胞E-selectin、P-selectin、ICAM-1和ICAM-1表達水平的上調。這些內皮分子共同介導了白細胞在動靜脈畸形血管中內皮上的翻滾、捕獲和遷移。放射介導的動靜脈畸形血管炎性反應在諸如內皮細胞死亡，細胞增殖以及血栓形成等進程中也起著重要作用。

放射可以誘導人腦動靜脈畸形病灶中血栓的形成。放射也可以影響在凝血和血栓形成過程中發(fā)揮重要作用的各種分子的表達[13-15]，如組織因子（TF）、血管性血友病因子和P-selectin[16-19]。TF正常表達于內皮下及血管外膜。大鼠動靜脈畸形經放療后，血管內皮損傷，導致內皮下成分暴露于管腔，從而將TF直接釋放到血液中[3，8]；因此，經放射的模型血漿中可檢測到sTF，且其濃度變化具有時間依從性。血管腔內出現的TF與閉塞性血栓形成反應有關。內皮下暴露的TF在介導動靜脈畸形血管血栓形成過程中發(fā)揮重要作用。因此，血漿中sTF水平可以早期預測動靜脈畸形病灶對放射治療是否有反應。目前本實驗通過對動物模型動靜脈畸形血管對放療后早期反應的研究累積了一些有用的數據，這些數據為進一步探索用于檢測放射治療后早期反應性的生化標志物奠定了基礎。

綜上所述，本研究證實了放射可介導大鼠模型動靜脈畸形中sE-selectin、sP-selectin、sICAM-1、sVCAM-1及sTF表達升高。因此，在不同時間點測定sP-selectin、sICAM-1、sICAM-1和sTF的水平，可用來評估動靜脈畸形對放射治療的反應性。

[參考文獻]

[1] Maruyama K，Kawahara N，Shin M，et al. The risk of hemorrhage after radiosurgery for cerebral arteriovenous malformations [J]. N Engl J Med，2005，352（2）：146-153.

[2] Luo CB，Guo WY，Chang FC，et al. Fistula component of cerebral arteriovenous malformation：morphologic change after sterotactic radiosurgery and outcome of embolization [J]. Acat Neurochir，2014，156（1）：85-92.

[3] Storer KP，Tu J，Stoodley MK，et al. Expression of endothelial adhesion molecules after radiosurgery in an animal model of arteriovenous malformation [J]. Neurosurgery，2010， 67（4）：976-983.

[4] Liu S，Sammons V，Fairhall J，et al. Molecular responses of brain endothelial cells to radiation [J]. Clin Neurosci，2012， 19（8）：1154-1158.

[5] 蘇海洋，申俊峰，侯宇希，等.人腦動靜脈畸形與鼠模型頸動靜脈畸形的組織學比較[J].中華神經外科雜志，2014， 30（3）：233-236.

[6] 侯宇希，胡志強，蘇海洋，等.腦海綿狀血管畸形與動靜脈畸形對放療的不同反應[J].中華神經外科雜志，2014，30（9）：869-872.

[7] Tu J，Stoodley MA，MK Morgan，et al. Responses of arteriovenous malformations to radiosurgery：ultrastructural chan-ges [J]. Neurosurgery，2006，58（4）：749-758.

[8] Storer KP，Tu J，Karunanayaka A，et al. Thrombotic molecules expression in cerebral vascular malformations [J]. Clini Neurosci，2007，14（10）：975-980.

[9] Ley K.The role of selectins in inflammation and disease [J]. Trends Mol Med，2003，9（6）：263-268.

[10] Alon R，Kassner PD，Carr MW，et al. The integrin VLA-4 supports tethering androlling in flow on VCAM-1 [J]. Cell Biol，1995，128（6）：1243-1253.

[11] Storer KP，Tu J，Karunanayaka A，et al. Inflammatory molecule expression in cerebral arteriovenous malformations [J]. Clini Neurosci，2008，15（2）：179-184.

[12] 潘劍.顱內動靜脈畸形的治療及放射外科治療現狀[J].中華神經外科雜志，2011，27（8）：859-862.

[13] Sun B，Liu H，Zhao F，et al. The rs9509 polymorphism of MMP-9 is associated with risk of hemorrhage in brain arteriovenous malformations [J]. Clini Neurosci，2012， 19（9）：1287-1290.

[14] Takaqi Y，Aoki T，Takahashi JC，et al. Differential gene expression in relation to the clinical characteristics of human brain ateriovenous malformation [J]. Neurol Med Chir，2014，54（3）：163-157.

[15] Tu J，Li Y，Hu ZQ，et al. Radiosurgery inhibition of the Notch signaling pathway in a rat model of arteriovenous malformations [J]. J Neurosurg，2014，1（10）：1-12.

[16] Jahroudi N，Ardekani AM，Greenberger JS，et al. Ionizing irradiation increases transcription of the von Willebrand factor gene in endothelial cells [J]. Blood，1996，88（10）：3801-3814.

[17] Verheij M，Dewit LG，Mourik JA，et al. The effectof ionizing radiation on endothelial tissue factor activity and its cellular localization [J]. Thrombo Haemost，1995，73（5）：894-895.

[18] Verheij M，Dewit LG，Boomgaard MN，et al. Ionizing radiation enhances platelet adhesion to the extracellular matrix of human endothelial cells by an increase in the release of von Willebrand factor [J]. Radiat Res，1994，137（2）：202-207.

[19] Lorenzet R，Napoleone E，Celi A，et al. Cell-cell interaction and tissue factor expression [J]. Blood Coagul Fibrinolysis，1998，9（Suppl 1）：S49-S59.

（收稿日期：2015-06-04 本文編輯：任 念）